p53、p21在氟中毒雌鼠卵巢早衰中的表达变化*

刘 洋，李艳菊，王 宁，刘振华，杨 华，刘燕青，王飞清△

(1.贵阳中医学院第一附属医院检验科，贵阳 550001；2.贵州医科大学附属医院血液科，贵阳 550004；3.贵州省骨科医院药剂科，贵阳 550002；4.贵州省人民医院肝胆外科，贵阳 550002)

研究显示，过量氟可导致机体氧化应激产物大量蓄积进一步损伤子宫、卵巢等生殖脏器[1-2]。当前，氟中毒对雌性机体损伤和防治是科研人员的难题，本课题组前期研究发现燃煤型氟中毒可影响雌鼠动情周期、性激素分泌、损伤卵巢超微结构[3-5]。实验报道，p53和p21在失重致雌鼠卵巢衰老中呈现高表达[6]。氟中毒是否通过激活衰老基因p53和p21的表达，促进卵巢过早衰老，影响雌性生殖功能的相关机制研究还未得到科研人员的关注。本课题组设计以SD雌鼠为研究对象，解析燃煤型氟中毒致雌鼠卵巢早衰影响因子，并为今后病区雌性生殖功能的防治工作起到重要意义，现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料 由贵州医科大学动物实验中心提供90～100 g清洁级SD大鼠24只，许可证号：SCXK(黔)2012-0001。实时定量荧光PCR(RT-PCR)由大连宝生物公司提供；引物序列primer3设计由上海英俊公司合成；PF-1型氟离子选择性电极由上海精密科学仪器有限公司生产；Olympus BX51双目光学显微镜由奥林巴斯光学工业株式会社生产。

1.2方法

1.2.1动物模型构建 适应性喂养1周，分为对照组、低氟组(25 mg/kg)、中氟组(50 mg/kg)、高氟组(100 mg/kg)，每组6只，每周调整鼠笼的位置，力求各组雌鼠的实验条件一致。各组自由饮水，自由食用不同配方的原煤加拌泥煤烘烤的玉米饲料，于染氟90 d处死。

1.2.2氟斑牙发生情况 每周观察各组大鼠牙齿变化情况，并判定大鼠牙齿的损伤程度并记录。处死大鼠前对各大鼠的牙齿进行拍照。具体氟斑牙分度参考国家标准分为正常、轻度、中度、重度[7]。

1.2.3尿氟和骨氟 采用氟离子选择电极法测定氟水平，具体参见既往实验[4]。

1.2.4光镜观察卵巢组织形态学变化 处死动物后，迅速取下一侧卵巢，经10%甲醛溶液固定3 d后，常规取材、脱水、石蜡包埋、切片、苏木精-伊红(HE)染色，光镜200倍镜下观察卵巢组织结构有无形态学改变。

1.2.5RT-PCR测定卵巢中p53、p21 mRNA表达 采用Trizol法提取雌鼠卵巢组织总RNA，根据试剂盒说明书具体方法进一步采用RT-PCR进行基因片段扩增并定量。各PCR反应管中所加模板RNA的量约为1 μg。p53、p21 PCR扩增条件为：RT-PCR 95 ℃ 5 s，59 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40个循环。Melt curve 95 ℃ 5 s，65 ℃ 5 s，60个循环。结果通过RT-PCR仪记录的Ct值对起始模板相对定量分析。

2 结 果

2.1氟斑牙发生情况 对照组均无氟斑牙出现，各染氟组随染氟剂量的升高，均出现不同程度的氟斑牙，数量分为(正常、轻度、中度、重度)：低氟组(2、4、0、0)、中氟组(0、3、3、0)、高氟组(0、0、2、4)，且氟斑牙症状呈逐渐加重趋势，见图1。

A：对照组牙齿；B：轻度氟斑牙；C：中度氟斑牙；D：重度氟斑牙

图1各组氟斑牙发生情况

2.2尿氟和骨氟情况 含氟量饲料摄入增加，尿氟水平逐渐升高，中氟组和高氟组与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。各染氟组组间比较，尿氟水平逐渐升高，高氟组与各组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。含氟量饲料摄入增加，骨氟水平逐渐升高，各染氟组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，各染氟组组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 尿氟和骨氟水平比较

a：P<0.05，与对照组比较；b：P<0.05，与低氟组比较；c：P<0.05，与中氟组比较

2.3各组雌鼠卵巢HE染色形态 各组雌鼠卵巢外观色泽鲜红，光镜下对照组卵巢组织结构形态正常，可见不同发育阶段的卵泡，颗粒细胞排列整齐。各染氟组卵巢间质正常，未见间质出血、水肿、间质纤维增生、组织变性坏死、炎性细胞浸润等组织形态异常。低氟组卵巢组织未见早衰，但染氟组随染氟剂量的增加，卵巢组织颗粒细胞水肿趋势加重，组织细胞形态损伤模糊，且闭锁的卵泡明显增加，黄体退化严重，成熟卵泡显著减少，卵巢呈现早衰迹象，见图2。

A：对照组；B：低氟组；C：中氟组；D：重氟组

图2各组卵巢形态情况(×200)

2.4各组雌鼠卵巢组织p53和p21表达结果 与对照组比较，低氟组p21增高，但差异无统计学意义(P>0.05)，其他各染氟组p53和p21比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；各染氟组组间比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 各组p53和p21表达

a：P<0.05，与对照组比较；b：P<0.05，与低氟组比较；c：P<0.05，与中氟组比较

3 讨 论

围绕燃煤型氟中毒这种地域性强、病区广、危害高、防治难的地方病一直是贵州省医疗领域长期重点攻关课题[8-9]。卵泡是卵巢的主要功能单位，卵巢实质内有许多不同发育时期的卵泡，且呈月周期变化[10]。GUNEY等[1]报道氟中毒可引发女性生殖系统功能的改变，对其性成熟、受孕及生殖器官的老化均有影响。流行病学调查显示高氟区女性月经初潮年龄较正常女性明显延迟，最长可相差2～3年。本实验HE染色结果发现，随染氟剂量的增加，卵巢组织颗粒细胞呈现轻度、中度、重度水肿的趋势，细胞形态损伤模糊，且闭锁的卵泡明显增加，黄体退化严重，成熟卵泡显著减少，导致卵巢储备下降并呈现早衰的迹象。

随着对地氟病损伤分子机制的不断深入研究，近年来氟中毒对女性卵巢生殖系统的影响逐渐引起重视。研究表明p53和p21表达情况受不同途径刺激有关，增加p53表达上调p21表达，这与细胞分裂周期、衰老和凋亡密切相关[11-13]。在p53的下游基因中，p21是p53执行激活细胞衰老的下游靶基因已为共识[14]。本课题组前期研究发现，p53和p21基因可调控骨髓间充质干细胞和心肌细胞衰老的作用[15-16]。LIU等[17]发现p53和p21表达增高促进卵巢颗粒细胞凋亡在雷公藤致卵巢早衰中起主导作用。本实验结果显示，随着染氟剂量增加，卵巢组织中p53和p21表达逐渐增高，提示燃煤型氟中毒可促进卵巢组织p53和p21表达。研究证实氟中毒对机体损伤主要是氧化应激产物的蓄积，由此推测燃煤型氟中毒导致雌鼠卵巢早衰可能是通过机体氧化应激产物蓄积，从而激活p53表达，进一步激活下游p21表达，促进卵泡闭锁，加速卵巢衰老，这与光镜卵巢HE染色结果相一致。

综上所述，燃煤型氟中毒可明显损伤卵巢组织，促进卵泡闭锁，且卵巢组织中衰老基因p53和p21表达增高，导致卵巢早衰，影响卵巢储备能力，因此控制氟的摄入是防治地氟病对机体损伤的有效方式。本实验还补充氟中毒对雌性生殖系统早衰的空白，对进一步为我国氟中毒灾区女性生殖健康预防提供相关数据，为防治氟中毒有重要意义。

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