探讨γδT细胞在小鼠胰岛移植排斥反应中的作用*

李传贵,宋亚军,杨加彩,黄赤兵△

(1.解放军第八十八医院泌尿外科，山东泰安 271000；2.陆军军医大学新桥医院泌尿外科，重庆 400037)

Ⅰ型糖尿病是一种T淋巴细胞介导的自身免疫性疾病，属于器官特异性自身免疫性疾病。目前胰岛移植是治疗Ⅰ型糖尿病的理想方法，Edmonton方案(即应用不含激素的免疫抑制剂，并采用改良的非连续密度梯度离心法分离胰岛，使胰岛移植治疗Ⅰ型糖尿病的成功率大幅度提高)的推广，标志着胰岛移植具备了临床应用的实际价值，但是胰岛移植后移植物长期存活仍是一个有待解决的关键问题。其中，排斥反应是导致移植后器官功能丧失的最主要原因，是移植物长期存活的主要障碍[1-3]。激活后的γδT细胞可内源性诱导Treg细胞、分泌白细胞介素(IL)-10和转化生长因子-β(TGF-β)等免疫抑制因子，从而发挥免疫抑制作用。结合以上观点，本文设计小鼠胰岛移植模型，进一步探讨γδT细胞在胰岛移植排斥反应中的作用[3]。

1 材料与方法

1.1材料 Bablc小鼠，8～12周龄，雄性，若干，作为供体,分离提取胰岛细胞。野生型C57小鼠，8～12周龄，雄性，健康状况良好设为野生型小鼠组；部分野生型C57小鼠用于提取肠上皮内γδT细胞，纯化后回输到γδ敲基因小鼠体内以此设立γδ敲基因回输γδT细胞小鼠组；γδ敲基因小鼠,8～12周龄，雄性，健康状况良好，设为γδ敲基因小鼠组，分别建立Ⅰ型糖尿病模型。所有小鼠均购于陆军军医大学动物实验中心，许可证号：SCXK(渝)201020102、SCXK(军)20102007，清洁(SPF)级实验动物房笼养1周后进行实验，每组10只小鼠。

1.2实验方法

1.2.1建立γδ敲基因再回输γδT细胞小鼠模型 取与γδ敲基因小鼠的同品系野生型C57小鼠，麻醉后浸泡于75%乙醇中10 min，置于无菌操作台，开腹后剪取小肠置于无菌PBS液中，彻底清除肠道内容物，剪成0.5 cm小段后放入预先配制的消化液中(RPMI-1640液中加入1 mmol/L二硫苏糖醇、1.5 mmol/L乙二胺四乙酸、10 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸)，265 r/min,37 ℃震荡消化30 min。消化后200目过滤，取悬液1 500 r/min离心5 min，PBS清洗1遍后，取细胞沉淀于70% Percoll混匀，上层缓慢加入40%Percoll，1 360 r/min离心20 min(Eppendorf Centrifuge 5424离心机)，分界面周围的细胞即为肠上皮内淋巴细胞。

取肠上皮内淋巴细胞用含钙、10% 胎牛血清(FBS)、500 U/mL青霉素和链霉素及1 μL/mL非必需氨基酸的RPMI-1640培养基培养(赛默飞世尔生物化学制品有限公司)，并以2 μL/mL Con A、1 μL/mL PMA、100 μL/mL IL-2(美国R&D公司)及1 mmol/L的唑来膦酸(美国Sigma公司)刺激，分别于1、7、14、21、28 d经流式细胞技术(美国Applied Biosystems公司)检测其γδT细胞含量。取经过刺激培养，且纯度较高的γδT细胞尾静脉回输给γδ敲除基因小鼠，每只小鼠输注5×106个γδT细胞。

1.2.2建立胰岛移植模型

1.2.2.1建立Ⅰ型糖尿病模型 各组小鼠禁食12 h，尾尖取血测空腹血糖(德国罗氏公司)。一次性腹腔注射1%链脲佐菌素溶液150 mg/kg,72 h后测空腹血糖，空腹血糖连续2 d高于16.7 mmol/L，且出现明显多饮、多食和多尿症状，说明造模成功[4]。造模后每天更换小鼠垫料，保持环境干燥清洁。

1.2.2.2分离纯化胰岛细胞 Bablc小鼠，术前禁食12 h；用1%戊巴比妥钠腹腔麻醉后固定四肢成仰卧位，腹部备皮消毒，行V字型切开腹腔，充分暴露胆总管和胰管；用1号丝线结扎近十二指肠端胆总管，结扎时紧贴十二指肠壁；破心放血；在胆总管近肝门端用31G静脉穿刺针灌注冷的0.5 mg/mL V型胶原酶(美国Sigma公司)2～3 mL，使胰腺充分膨胀；迅速摘取整个胰腺移入预置2 mL胶原酶的50 mL三角烧瓶中，放入38 ℃恒温水浴锅中静止消化；消化25 min后取出烧瓶，震荡使胰腺组织充分分散，成泥沙状；加入4 ℃含10%胎牛血清的Hanks液20 mL终止消化，用50目不锈钢网过滤，去除未消化的组织；将滤过的细胞悬液移入50 mL离心管中4 ℃，1 000 r/min离心2 min，去上清后重复离心1次；将分离好的胰岛组织沉淀用Histopaque-1077分离液混悬，上层加RPMI-1640培养基，2 000 r/min离心20 min(缓慢加速，减速)后吸取分界面的胰岛细胞，用4 ℃Hanks液离心洗涤2次备用；用双硫腙(DTZ)染液1∶10与所得胰岛混合10 min后镜下观察，直径50～150 μm，呈猩红色的细胞即为胰岛细胞[5]。

1.2.2.3胰岛移植 挑取直径大于100 μm的胰岛300～400个(图1)，低速离心后加入PE50软管内备用。取受体小鼠麻醉，左肋下开腹，充分暴露左肾，于肾下极包膜处剪开一长约0.3 cm切口。PE50管插入肾包膜约1 cm，缓慢注入，同时缓慢退出软管，为胰岛创造空间(图2)。移植后分别于1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29 d测量空腹血糖，并于术后两周取移植物观察病理情况。

图1 胰岛细胞团

图2 胰岛移植

1.3观察指标 (1)小鼠小肠γδT细胞体外刺激培养前后流式细胞技术检测；(2)血糖值：每天剪取小鼠尾部血管少许血液检测血糖；(3)存活时间：从建立糖尿病模型后开始到小鼠死亡，记录为存活时间；(4)病理检查：移植后两周取肾，HE染色后在显微镜下读片。

2 结 果

2.1小鼠小肠γδT细胞体外刺激培养前后流式细胞技术检测结果 野生型C57小鼠分离纯化γδT细胞，初步比例约占25%(图3)。通过进一步刺激培养，28 d后流式细胞仪鉴定可获得纯度约60%的γδT细胞(图4)，并静脉回输至γδ敲基因小鼠体内建立γδ敲基因回输γδT细胞小鼠。

图3 初步分离纯化后所得γδT细胞流式图

图4 培养刺激后所得γδT细胞流式图

2.2Ⅰ型糖尿病小鼠造模及移植后存活情况 各组小鼠建立Ⅰ型糖尿病小鼠均达到10只，造模过程中野生型小鼠组出现1只因血糖过高死亡，其余两组均有2只因感染死亡。野生型小鼠组存活时间(27±2)d和γδ敲基因再回输小鼠组存活时间(24±1)d长于γδ敲基因小鼠(17±3)d，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3血糖值 图中野生型小鼠组在(24±2)d移植物基本被排斥，γδ敲基因小鼠静脉再回输γδT细胞小鼠组在(21±1)d基本被排斥，γδ敲基因型小鼠组在(14±2)d基本被排斥。野生型小鼠组和γδ敲基因再回输小鼠组血糖升高明显慢于γδ敲基因型小鼠组，差异有统计学意义(P<0.05)；而野生型小鼠组和γδ敲基因再回输小鼠组血糖变化无明显差异(P>0.05)。见图5。

图5 各组小鼠胰岛移植后血糖变化曲线

图6 野生型C57小鼠移植物病理(HE×200)

图7 γδ敲基因小鼠移植物病理(HE×200)

图8 γδ敲基因再回输型小鼠移植物病理(HE×200)

2.4病理检查 观察移植物移植2周后细胞形态的完整性，图中HE染色，肾组织外蓝色细胞即为小鼠胰岛细胞。显微镜下结果显示宿主野生型C57小鼠肾包膜内的胰岛细胞形态规整(图6)，γδ敲基因再回输小鼠组胰岛细胞数量较多，但形态有一定程度的破坏(图8)，而γδ敲基因小鼠胰岛细胞数量少，且形态不规则(图7)。

3 讨 论

糖尿病是一种严重影响人类生活质量的慢性病，其患病率近年来不断上升，目前的治疗方法，如胰岛素治疗，只能控制病情进展，不能根治此类疾病[6-8]。而胰岛移植是一种有望彻底根治糖尿病，特别是Ⅰ型糖尿病的治疗方法。但是同种异体胰岛移植后产生的免疫排斥反应，导致移植后胰岛细胞凋亡，是影响胰岛移植成功率的最大障碍。Albert大学进行的65例胰岛移植患者在应用常规药物进行移植后免疫抑制时发现，胰岛移植相对于其他脏器移植有更大比例的患者因出现更复杂且更严重的不良反应而联用更多种类的药物，甚至停用免疫抑制剂，最后导致移植物丢失。因此，如何诱导并维持免疫耐受是一个急需解决的难题，目前诱导和维持免疫耐受的方法很多，如特异性全血输注，脾细胞或骨髓细胞输注等方法[9-10]。但是由于操作难度大，流程复杂，效率低和不良反应大等原因而不能在临床推广。在免疫耐受的机制中，γδT细胞起着非常重要的作用。γδT细胞激活后既可以诱导抗原特异性Treg 细胞增殖，还可以分泌大量的IL-10、TGF-β及巨噬细胞移动抑制因子等抑制性细胞因子。现有大量文献证明Treg是机体维持自身耐受的重要组成部分，其在治疗胰岛移植排斥反应中起着诱导同种移植耐受和维持自身耐受的双重作用[11-12]。IL-10和TGF-β作为抑制性细胞因子，是γδT细胞和Treg发挥作用的直接效应分子。这说明通过激活γδT细胞、扩增Treg并分泌IL-10和TGF-B等细胞因子，可以抑制免疫排斥反应。

本研究中，野生型糖尿病小鼠和γδ敲基因再回输γδT细胞型糖尿病小鼠移植后血糖很快恢复正常，且能保持3周处于正常水平，并且术后存活时间更长，而γδ敲基因型糖尿病小鼠移植后2周血糖即重新升高到糖尿病水平。病理结果同样提示移植2周后，野生型糖尿病小鼠和γδ敲基因再回输γδT细胞型糖尿病小鼠肾包膜下仍然有大量形态较规则的胰岛细胞团，而γδ敲基因型糖尿病小鼠肾包膜下只有少量且形态模糊的胰岛细胞团。说明γδT细胞在胰岛移植后保持移植物存活，维持血糖正常中起着重要作用，对在胰岛移植中寻找诱导免疫耐受提供了一种新的思路，为进一步研究γδT细胞在胰岛移植诱导免疫耐受中的作用机制及信号靶点奠定了基础。

尽管胰岛移植能治愈糖尿病，且其原理已明确，但是关于移植的时机、具体的量效关系、宿主遗传背景及年龄等具体因素还需要进一步研究[13]。同时，移植后如何长期维持移植物活性的具体方案还不成熟。不过随着γδT细胞诱导免疫耐受研究的不断深入，胰岛移植治疗糖尿病的应用前景将很广阔。

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