贵州壮族人群25个Y-STR基因座遗传多态性*

国学红，何燕，张秀秀，张婷，王婵娟，官志忠

（地方病与少数民族性疾病教育部重点实验室∥贵州省分子生物学重点实验室∥贵州医科大学，贵州贵阳550004）

Y染色体短串联重复序列（Y-STR）是指位于男性Y染色体上非重组区上的人类多态性位点。其主要特征表现为个体不同，核心碱基序列重复次数不同。是研究父系溯源、迁徙进化、家系识别等方面的重要遗传标记，该遗传标记具有连锁遗传、单倍型父系遗传等特征[1]。目前，Y-STR分型技术已成为法医学、群体遗传学及人类学研究的主流技术[2-3]。研究发现，适当增加Y-STR基因座有利于提高个体的识别力，可以有效解决单个或几个基因座的遗传多态性对个体识别能力不足的问题。本文拟采用Y27Plex荧光试剂盒，在包含AmpFISTR Y-filer 16个Y-STR基因座的基础上，新增了9个Y-STR基因座。利用该试剂盒重建贵州世居少数民族壮族父系遗传史，探讨贵州世居少数民族壮族与其他12个群体间的遗传结构和遗传分化关系，从分子水平上研究壮族的起源及迁徙，为其在法医学个体识别和亲权鉴定以及人类遗传学方面的研究提供数据支撑。

1 材料和方法

1.1 研究对象

67例壮族男性DNA样本来自于贵州黔东南苗族侗族自治州从江县刚边乡银屏村，根据知情同意原则，每个个体采集静脉血2 mL。采样标准：3代内民族单一且无族外通婚，个体间无血缘关系。从公共数据库（http：∥yhrd.org）获得广西壮族[4]、福建畲族[5]、云南哈尼族[6]、内蒙古蒙古族[7]、山西汉族[8]、新疆哈萨克族[9]、新疆维吾尔族、安多藏族[10]、辽宁满族[11]、吉林朝鲜族[12]、西非人群[13]、萨尔茨堡[14]等群体的单倍型数据作为比较数据。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及模板的标化 用经典的酚-氯仿法提取抗凝全血 DNA，用美国 BECKMANDU640核酸蛋白分析仪检测DNA样本的浓度和纯度，取少量DNA样本标准化质量浓度为10 ng/μL，作为PCR扩增的模板。

1.2.2 PCR扩增 采用Y27Plex荧光检测试剂盒，用美国ABI 2720 Thermal cycler PCR仪进行扩增。扩增体系为10μL，其中 2.5×PCR Mix 4μL，Y 27Plex Primer 2μL，Taq DNA聚合酶0.4μL，DNA模板1μL，PCR Grade Water 2.6μL。PCR扩增程序设置：95℃预变性3 min，30个循环中每个循环94℃变性20 s，59℃复性1 min，72℃延伸1 min，终60℃延伸30 min，4℃保存。

1.2.3 扩增片段的电泳与分型 取PCR扩增产物1.5μL加入8.85μL Hi-DiTMformamide和0.15μL相对分子质量内标（Standard Org 500）的混合液，在ABI 3130XL全自动遗传分析仪上进行电泳，采用Data Collection及GeneMapper软件收集电泳数据并进行分析，获得25个Y-STR分型结果。

1.2.4 数据统计分析 25个Y-STR基因座等位基因频率、单倍型频率采用直接计数法计算；单倍型多样（Haplotype diversity，HD）、基因多样性（Gene diversity，GD）根据公式GD＝n（1-ΣPi2）/（n-1）计算，其中n为样本数，Pi为单倍型频率或等位基因频率；遗传距离Rst矩阵采用Arlequin 3.5软件进行 AMOVA分析，NJ系统发生树（Neighbour Joining tree）和聚类分析（UPGMA）采用Mega 7.0软件；多维标度分析（MDS）采用SPSS 19.0软件。

2 结 果

2.1 贵州壮族67例男性样本25个Y-STR基因座遗传多态性

本文采用Y27Plex荧光检测试剂盒对25个YSTR基因座进行复合扩增。各基因座分型结果清晰准确，峰高比例均衡。67例贵州世居少数民族壮族无关男性个体的25个Y-STR基因座等位基因及GD值（见表1）。除两个双拷贝基因座DYS385ab、DYS387S1分别检出8、10个等位基因外，其余23个Y-STR基因座均为单拷贝基因座，共检出86种等位基因，等位基因个数为2～7不等，等位基因频率为（0.014 9～0.970 1），基因多样性GD值为DYS456（0.058 8）～DYS387S1（0.823 6）。25个Y-STR基因座组成的单倍型共检出36种（见表2），其中单倍型 H04检出 11次，单倍型 H18、H28各检出5次，其余单倍型检出1～4次，单倍型多样性HD为0.957 9。鉴于Y染色体单倍型多样性值与个人识别能力、非父排除率具有相同意义。而本文Y染色体单倍型值达到了0.95以上，因此适用于个体识别、家系鉴别及群体遗传学研究。

表1 贵州世居少数民族壮族25个Y-STR基因座等位基因及GD值Table 1 Allele and Genetic diversity values of 25 Y loci in Zhuang population from Guizhou

续上表

表2 贵州世居少数民族壮族25个Y-STR基因座单倍型Table2 Haplotype distributions for the25Y loci in Zhuang e thnic group from Guizhou

2.2 贵州世居少数民族壮族与国内外12个群体间的遗传距离与系统发生树

选取本文获得的贵州世居少数民族壮族16个Y-STR（DYS19、DYS389Ⅰ、DYS389Ⅱ、DYS390、DYS391、 DYS392、 DYS393、 DYS437、 DYS438、DYS439、 DYS448、 DYS456、 DYS458、 DYS635、Y-GATA-H4、DYS385ab）基因座遗传学数据，通过分子方差分析（Analysis of Molecular Variance，AMOVA）得到13个群体间的遗传距离（表3）。研究结果显示13个群体的遗传距离在0.006 19～0.520 37之间，其中山西汉族与辽宁满族的遗传距离最小（0.006 19），贵州壮族与澳大利亚的西非人群遗传距离最大（0.520 37）。本次研究的贵州世居少数民族壮族与福建畲族、内蒙蒙古族、山西汉族的遗传距离相对较近，与广西壮族、云南哈尼族、新疆哈萨克族、新疆维吾尔族、安多藏族、辽宁满族、吉林朝鲜族、萨尔茨堡人群的遗传距离稍远，与西非人群的遗传距离达到最大。对其他民族群体遗传距离进行比较发现，国内群体之间的遗传距离普遍小于与西非人群、萨尔茨堡人群的遗传距离。根据遗传距离构建的系统发生树（NJ）及聚类分析基本相符（图1、图2）。13个民族群体共分成3大支，福建畲族、内蒙古蒙古族、山西汉族、广西壮族、云南哈尼族、新疆维吾尔族、辽宁满族、吉林朝鲜族、新疆哈萨克族、安多藏族为一大支；西非人群、萨尔茨堡人群为一支；而贵州壮族与其它民族群体比较则自成一支。

表3 13个群体R st值遗传距离矩阵（对称轴上对应的P值，对称轴下是R st值）1）Table 3 Pairwise genetic distance between Guizhou Zhuang and other 12 published populations（Above diagonal：P values，Below diagonal：R stvalues）

图1 贵州世居少数民族壮族与其他12个民族群体的NJ系统发生树Fig.1 Neighbour Joining tree plot of the Zhuang population from Guizhou with other 12 different populations based on R ST

图2 贵州世居少数民族壮族与其他12个民族群体的聚类分析Fig.2 UPGMA plot of the Zhuang population from Guizhou with other 12 different populations based on R ST

图3 贵州世居少数民族壮族与其他12个民族群体的MDSFig.3 MDSplot of the Zhuang population from Guizhou with other 12 different populations based on R ST

3 讨 论

3.1 贵州世居少数民族壮族男性群体25个Y-STR基因座遗传多态性

本研究采用包含25个Y-STR遗传标记的Y27Plex荧光试剂盒对贵州世居少数民族壮族男性群体的遗传多态性进行分析，结果发现有1/3基因座在贵州壮族中遗传多态性较低，如 DYS391、DYS437、DYS438、DYS456等基因座，其中DYS438基因座遗传多态性达到最低（0.059 2）。据文献报道DYS438基因座在重庆酉阳土家族[15]、皖南汉族[16]、广西苗、瑶、侗族[17]、塞尔维亚[18]人群中遗传多态性均表现不高。而在甘肃东乡族[19]、印度中央邦[20]、孟加拉国[21]、西班牙[22]等人群中的遗传多态性较高。相比而言，DYS19、DYS389I、DYS389II、DYS392、DYS393、DYS449、DYS458、DYS518等基因座遗传多态性较高。其中双拷贝基因座DYS385、DYS387S1遗传多态性最高。该基因座通过一对引物与Y-DNA序列的两个区域分别结合得到两种扩增产物，该产物有助于提高个体识别。本研究在壮族群体DYS387S1基因座检出20例三等位基因模式，这种多拷贝现象在其他群体[23-24]也曾报道。而本文参考的民族群体中未发现这种特殊基因型，提示这种异常分型结果所表现出群体差异有利于推断父系种族或群体来源。被分析的67例男性样本共检测出36种单倍型，其中66.7%单倍型检测出1次，单倍型多样性为0.957 9。与包含16个Y-STR遗传标记的Yfiler试剂盒比较。发现Y27Plex荧光试剂盒新增的9个YSTR（DYS481 、DYS533、DYS627、DYS460、DYF387S1、DYS576、DYS518、DYS570、DYS449）基因座使原来的单倍型数量由19种增加到36种，单倍型多样性由0.863 0达到0.957 9。9个Y-STR除DYS627、DYS460、DYS570基因座外，其余6个基因座的遗传多样性达到了0.6以上。提示相应的增加Y-STR基因座，系统的鉴别能力会增加。提示25个基因座在贵州世居少数民族壮族中具有较好的多态性和识别力，适用人类学、群体遗传学研究。

按照以下顺序排列组成单倍型DYS19/DYS389Ⅰ/DYS389Ⅱ /DYS390/DYS391/DYS392/DYS393/DYS437/DYS438/DYS439/DYS448/DYS456/DYS458/DYS635/Y-GATA-H4/DYS385ab，经 Arlequin3.5软件计算13个民族群体的2 214例男性样本共得到1 852种单倍型，其中绝大多数单倍型是唯一的，只有少部分单倍型发生共享。本次研究贵州壮族群体与其他12个群体之间未发现共享单倍型，提示16个Y-STR基因座组成的单倍型具有贵州壮族特征，这种显著的民族差异为法医学的研究提供重要线索。

3.2 贵州世居少数民族壮族与国内外12个群体间的遗传距离与系统发生树

壮族是我国岭南土著民族，属古百越中西瓯骆越之后裔，全国壮族人口有1 600多万，主要分布于广西、贵州等地。目前，贵州省境内壮族有3.3万人，主要聚居于从江、黎平、都匀、贵阳等县市。据贵州省民族志记载，贵州壮族先祖自宋元以后逐渐由广西迁入贵州，并与当地苗族、侗族杂居，因此该民族遗传结构相对比较复杂。本文利用Y-STR遗传多态性分析贵州世居少数民族壮族男性群体的遗传结构并与其它群体的遗传关系，为研究壮族起源及迁徙提供遗传学数据。

本文通过对归属于汉藏语系的汉语族（汉族）、壮侗语族（壮族）、苗瑶语族（畲族）、藏缅语族（哈尼族、藏族）和归属于阿尔泰语系的蒙古族（内蒙古蒙古族）、突厥语族（哈萨克族、维吾尔族、朝鲜族）及通古斯语族的满族（辽宁满族）13个群体的AMOVA分析发现，Y-STR的遗传多态性分布受地域、民族、种族等因素影响。从本文来看，贵州壮族人群父系遗传结构与福建畲族、内蒙古蒙古族、山西汉族人群较为相似，与广西壮族、云南哈尼族、新疆维吾尔族、辽宁满族、吉林朝鲜族、萨尔茨堡人群差异明显。而与新疆哈萨克族、安多藏族、西非人群差异显著。究其原因有：①随着社会经济、文化发展，部分民族群体经历了迁徙、融合、混居过程，导致民族遗传结构比较复杂。如本文研究的贵州壮族与广西壮族虽是同源民族，但受地理位置、生活环境等因素影响，遗传结构也发生了改变。②民族起源不同。如云南哈尼族是一个跨境而居的国际性民族。而维吾尔族与哈萨克族是具有欧洲和东亚人群基因的民族，以上民族由于距离较远，彼此之间缺乏基因交流，使得各民族间遗传特点表现出较大差异。从系统发生树上看，13个民族群体共分成3大支，其中福建畲族、内蒙古蒙古族、山西汉族、广西壮族、云南哈尼族、新疆维吾尔族、辽宁满族、吉林朝鲜族、新疆哈萨克族、安多藏族聚为一大支；西非人群、萨尔茨堡人群为一支；而贵州壮族与其它民族群体比较则自成一支，究其原因可能与本研究中壮族群体样本数过少有关，致使存在较大偶然性，未能反映出真实遗传差异。从MDS（图3）上看，内蒙古蒙古族、山西汉族与国内其他民族群体比较亲密，贵州壮族与新疆的少数民族有一定距离，西非人群与萨尔茨堡人群最远。综上所述，16个YSTR基因座组成的单倍型能够反映出以上群体在一定时期呈稳定遗传，基因流动方向与地理位置改变密切相关。

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