保存温度对茵芋花粉活力的影响

兰思仁, 郑天汉, 阮淑明, 华伟平, 吴远彬

(1.福建农林大学园林学院，福建 福州 350002；2.福建林业厅世行办，福建 福州 350003；3.福建林业职业技术学院林学系，福建 南平 353000；4.福建省生态产业绿色技术重点实验室，福建 武夷山 354300；5.福建林业勘察设计院，福建 福州 350001)

茵芋(SkimmiareevesianaFortune)为芸香科(Rutaceae)茵芋属(Skimmia)植物[1]，宜盘景栽培，秋冬季节红果满枝，久留不落，观赏效果极佳，是一种理想的园艺观赏植物[2].茵芋为福建典型的极小种群植物，目前福建仅发现野生茵芋5株(丛)，种质资源保护、种质材料离体保存十分迫切；茵芋雌雄异株，雌雄花期经常不一致[3-4]，严重影响雌花授粉和结实；自然条件下,茵芋花粉寿命短暂，通常只有数天至十余天，很难满足人工栽培或杂交育种等需求.因此，开展茵芋花粉保存方式的研究，对解决花期不遇、提高雌花授粉率、异地授粉、杂交育种、种质离体保存等方面具有重要意义.前人[5-6]研究表明，影响植物花粉保存活力的外部因素主要有保存温度、保存时间、花粉含水量、预冻处理、解冻方法等，一般在低温、低湿、无氧条件下更易保存，并且在多种植物花粉保存方式的研究中取得成功，在实践中也得到了应用，但至今尚未见有关茵芋花粉保存的报道.本研究在2015—2016年预试验的基础上，探索茵芋花粉在6种保存温度下随着保存时间变化的活力效应，旨在为茵芋人工辅助授粉、种质基因保存、异地授粉、杂交育种等提供依据.

1 材料与方法

1.1 材料

供试茵芋来源于福建省宁德市绿宝农业综合发展有限公司培育的3年生盘栽植株.2017年2月19日选取生长健壮、无病虫害、花序发育良好、花药饱满的雄株6棵，植株平均高27 cm，平均冠幅25 cm.花粉于2017年3月20日(即盛花期)在福建省林业职业技术学院分子生物学实验室进行提取、收集、保存、后续试验.

1.2 试验设计

2011—2017年对福建域内栽培的茵芋花期连续观察发现：雄花期始于春节前后，盛花期在3月中旬，持续至4月底；雌花期始于2月中旬，盛花期在4月中旬，持续至4月下旬；雌、雄盛花期相差约1个月.另据2016年保存茵芋花粉的预试验，发现0 ℃下保存400 d的花粉活力个别检测值仍能达到70%以上.因此，本研究采用保存温度、保存时间的双因素、多水平试验方案，采用-20、-12、0、4、6 ℃及室温自然保存的6种处理，检测时间分别设定于新鲜花粉采集当日、保存1～15 d以及30、60、90 d共19个时间节点.

1.3 花粉的提取与保存

于盛花期剪取茵芋雄花序，用镊子、解剖刀剥除花瓣，留下花药，置称量纸上于室温下晾干2 h.由于茵芋花药散粉不完全，因此用称量纸包起将要散粉的花药一起放入底部装有干燥剂的5 mL指形离心管中密封保存.每个离心管放3个花药，每次检测时取出一个离心管，花药在室温下自然散粉后进行活力检测，离心管则不再放入冰箱以避免频繁取样影响冷藏环境.

根据试验设计，将花粉分别置-20、-12、0、4、6 ℃及室温下保存.其中，-20 ℃下保存的花粉置BCD-539WT型海尓冷冻冰箱中，-12 ℃下保存的花粉置DW-25L262型海尔医用低温保存箱中，0、4 ℃下保存的花粉置普通海尓冰箱中，6 ℃下保存的花粉置SHP-1500型生化培养箱中，室温为9～25 ℃.-20、-12、0 ℃下保存的花粉直接在室温下化冻.

1.4 花粉活力的测定

采用IBE2000型倒置生物荧光显示镜随机选取视窗，拍摄10～20个照片，从中筛选出花粉数量不少于30粒的视窗照片10张(即10次重复)，计算花粉活力.花粉活力检测采用本课题组前期研究确认有效，且技术较成熟的红墨水染色法[7].花粉活力/%=被染色的花粉粒数/视野中的花粉粒总数×100.

1.5 数据分析

试验数据采用Excel、SPSS软件进行统计分析.

2 结果与分析

2.1 -20、-12 ℃下保存对茵芋花粉活力的影响

图1 -20 ℃下茵芋花粉的活力Fig.1 Pollen vitality of S.reevesiana under -20 ℃

-20 ℃下保存1、15、30、60、90 d，茵芋花粉活力分别为95.5%、67.4%、64.9%、67.4%、63.8%，表明在-20 ℃下保存15～90 d的花粉活力基本趋于稳定.茵芋花粉在-20 ℃下保存,其活力能保持在50%以上,能较长时间保存.-20 ℃下不同保存时间对花粉活力的影响见图1.

图1显示，-20 ℃下茵芋花粉活力随着保存时间的延长呈下降的趋势,0～15 d，花粉活力下降较快，之后花粉活力维持在60%～70%.拟合分析表明，花粉活力与保存时间呈抛物线型关系，相关系数为0.945.方差分析(表1)表明，-20 ℃下保存1 d的花粉活力与保存3 d的差异显著，而保存4 d以上的花粉活力与保存1 d的差异极显著.

表1 6种保存温度下茵芋花粉活力效应的单因素方差分析1)Table 1 Single factor variance analysis of pollen viability of S.reevesiana under 6 storage temperatures

1)**表示差异极显著(P<0.01)，*表示差异显著(P<0.05).

-12 ℃下保存1、15、30、60、90 d，茵芋花粉活力分别为91.8%、67.1%、63.7%、65.1%、62.4%，表明在-12 ℃下保存15～90 d的花粉活力基本趋于稳定,这与-20 ℃下花粉活力的变化趋势相接近.-12 ℃下不同保存时间对花粉活力的影响见图2.

图2显示，-12 ℃下茵芋花粉活力随着保存时间的延长呈下降的趋势,0～15 d，花粉活力下降较快，之后花粉活力维持在60%～70%.拟合分析表明，花粉活力与保存时间呈抛物线型关系，相关系数为0.912.方差分析(表1)表明，-12 ℃下保存1 d的花粉活力与保存7 d的差异显著，而保存8 d以上的花粉活力与保存1 d的差异极显著.与-20 ℃相比,-12 ℃下保存的花粉活力在7 d后差异明显,表明在-12 ℃下短时间内保存具有一定优势.若要长时间保存，-20 ℃下保存优于-12 ℃下保存.

2.2 0、4、6 ℃及室温下保存对茵芋花粉活力的影响

0 ℃下保存1、15、30、60、90 d，茵芋花粉活力分别为88.5%、73.5%、69.8%、61.6%、50.6%，与-20、-12 ℃相比，其活力有所下降.其中，0 ℃下保存90 d的花粉活力与-20 ℃相比下降20%，与-12 ℃相比下降19%，表明0 ℃较-20、-12 ℃更难保存花粉.0 ℃下不同保存时间对花粉活力的影响见图3.

图2 -12 ℃下茵芋花粉的活力Fig.2 Pollen vitality of S.reevesiana under -12 ℃

图3显示，0 ℃下茵芋花粉活力随着保存时间的延长呈下降的趋势,0～15 d，花粉活力下降较快，之后花粉活力维持在50%～70%.拟合分析表明，花粉活力与保存时间呈抛物线型关系，相关系数为0.919.方差分析(表1)表明，0 ℃下保存1 d的花粉活力与保存4 d的差异显著，而保存8 d以上的花粉活力与保存1 d的差异极显著.

4 ℃下保存1、15、30、60、90 d，茵芋花粉活力分别为91.4%、69.7%、70.9%、53.1%、31.7%，与-20、-12、0 ℃相比，其活力有所下降.其中，4 ℃下保存90 d的花粉活力与-20、-12、0 ℃相比分别下降50%、49%、37%，表明4 ℃较-20、-12、0 ℃更难保存花粉.4 ℃下不同保存时间对花粉活力的影响见图4.

图4显示，4 ℃下茵芋花粉活力随着保存时间的延长呈下降的趋势,0～15 d，花粉活力下降较快，之后花粉活力维持在30%～60%，表明4 ℃下保存的花粉活力明显下降.拟合分析表明，4 ℃下保存的花粉活力与保存时间呈抛物线型关系，相关系数为0.971.方差分析(表1)表明，4 ℃下保存1 d的花粉活力与保存4 d的差异极显著，表明4 ℃下，茵芋花粉较难保存.

6 ℃下保存1、15、30、60、90 d，茵芋花粉活力分别为91.2%、68.8%、46.9%、21.9%、11.4%，与-20、-12、0、4 ℃相比，其活力有所下降，其中，6 ℃下保存90 d的花粉活力与-20、-12、0、4 ℃下保存90 d相比分别下降80%、82%、77%、64%，表明6 ℃不适合花粉长时间保存.6 ℃下不同保存时间对花粉活力的影响见图5.

图4 4 ℃下茵芋花粉的活力Fig.4 Pollen vitality of S.reevesiana under 4 ℃

图5显示，6 ℃下茵芋花粉活力随着保存时间的延长呈下降的趋势,0～15 d，花粉活力下降较快，之后花粉活力维持在10%～50%，表明6 ℃下保存的花粉活力明显下降.拟合分析表明，花粉活力与保存时间呈抛物线型关系，相关系数为0.984.方差分析(表1)表明，6 ℃下保存1 d的花粉活力与保存11 d以上的差异极显著.

图6 室温下茵芋花粉的活力Fig.6 Pollen vitality of S.reevesiana under room temperature

室温下保存1、15、30、60、90 d，茵芋花粉活力分别为90.8%、32.7%、19.5%、11.3%、0，与-20、-12、0、4、6 ℃相比，花粉活力明显下降，其中，保存90 d的花粉活力为0，表明花粉不适合在室温下长时间保存.室温下不同保存时间对花粉活力的影响见图6.

图6显示，室温下茵芋花粉活力随着保存时间的延长呈下降的趋势,0～15 d，花粉活力下降较快，之后随着保存时间的延长，花粉失去活力.拟合分析表明，花粉活力与保存时间呈抛物线型关系，相关系数为0.960.方差分析(表1)表明，室温下保存1 d的花粉活力与保存6 d的差异显著，而保存7 d以上的花粉活力与保存1 d的差异极显著，表明在室温下保存5 d的花粉具有一定的活力.

2.3 不同保存方式对茵芋花粉活力的影响

2.3.1 不同保存温度的影响 -20、-12、0、4、6 ℃及室温下，茵芋花粉活力随着保存时间的变化趋势(图7)显示，随着保存天数的变化，不同保存温度下花粉活力的变化趋势大致相同，即随着保存天数的增加，花粉活力下降.保存15 d后，-20 ℃下保存的花粉活力与-12 ℃下保存差异不大，而0、4、6 ℃及室温下保存的花粉活力差异较大.

保存温度、保存时间双因素方差分析结果(表2)表明，6种温度下保存6 d，茵芋花粉活力差异显著，7 d后则差异极显著.-20、-12、0、4、6 ℃及室温下保存6 d，花粉活力分别为84.2%、83.5%、76.1%、78.2%、79.5%、76.6%，对花粉活力影响程度的大小为：-20 ℃<-12 ℃<6 ℃<4 ℃<室温<0 ℃.可见， -20、-12 ℃下保存对花粉活力的影响较小，其他4种温度则有较大影响，初步显示了6种保存温度在短期内对花粉活力影响的差异程度.

图7 6种保存温度下茵芋花粉的活力趋势Fig.7 Vitality trend of S.reevesiana pollen under 6 levels of preservation temperatures

保存时间dF统计量数值保存时间dF统计量数值保存时间/dF统计量数值1～2F(5,114)1.9631～8F(5,474)4.505**1～14F(5,834)15.234**F(1,118)3.964**F(7,471)17.149**F(13,826)37.869**F(5,114)0.518F(34,445)0.243F(65,774)1.469*1～3F(5,174)1.4351～9F(5,534)6.242**1～15F(5,894)21.567**F(2,177)5.588**F(8,531)22.112**F(14,885)44.081**F(10,167)0.26F(40,499)0.502F(70,829)1.836**1～4F(5,234)1.6711～10F(5,594)7.273**1～15、30F(5,954)32.640**F(3,236)12.779*F(9,590)24.737**F(15,944)54.911**F(15,224)0.337F(45,554)0.480F(75,884)2.648**1～5F(5,294)2.0771～11F(5,654)7.994**1～15、30、60F(5,1014)49.851**F(4,295)13.729**F(10,649)30.303**F(16,1003)72.092**F(20,279)0.240F(50,609)0.583F(80,939)4.068**1～6F(5,354)2.872*1～12F(5,714)8.093**1～15、30、60、90F(5,1074)71.264**F(5,354)13.985**F(11,708)35.251**F(17,1064)97.213**F(25,334)0.229F(55,664)0.720F(84,994)5.535**1～7F(5,414)3.480**1～13F(5,774)10.531**F(6,413)14.751**F(12,767)34.675**F(30,389)0.239F(60,719)0.983

1)**表示差异极显著(P<0.01)，*表示差异显著(P<0.05).

表2表明，6种保存温度与保存时间对花粉活力影响的交互效应于14 d时达到显著，15 d后达到极显著.保存14 d时，-20、-12、0、4、6 ℃及室温下保存的花粉活力分别为72.4%、67.7%、73.5%、69.7%、68.8%、34.1%，对花粉活力影响程度的大小为：0 ℃<-20 ℃<4 ℃<6 ℃<-12 ℃<室温.6种保存温度与保存时间交互效应达显著差异的时间节点为14 d，初步显示了茵芋花粉短期保存的适宜时间为14 d.

综上所述，茵芋花粉长期保存的温度为-20 ℃或-12 ℃，保存90 d的花粉活力仍具有63.8%以上；短期保存的温度为0、4、6 ℃，保存14 d的花粉活力仍然达到68.8%以上.

2.3.2 不同保存时间的影响 6种保存温度下，茵芋花粉活力基本上随着保存时间的延长缓慢下降.由于6种保存温度差异较大，为进一步明晰差异来源，将-20、-12 ℃下保存归为第1组，0、4、6 ℃及室温下保存归为第2组，0、4、6 ℃下保存归为第3组，分别进行差异来源分析与比较，结果如表3、4、5所示.

表3 -20、-12 ℃下茵芋花粉活力效应的方差分析1)Table 3 Variance analysis of the effect of -20 and -12 ℃ storage on pollen vitality of S.reevesiana

1)**表示差异极显著(P<0.01).

表4 0、4、6 ℃及室温下茵芋花粉活力效应的方差分析1)Table 4 Variance analysis of the effect of 0,4, 6 ℃ and room temperature storage on pollen vitality of S.reevesiana

1)**表示差异极显著(P<0.01)，*表示差异显著(P<0.05).

表3显示：-20、-12 ℃下保存4～90 d的花粉活力差异极显著，但保存温度与保存时间的交互效应均不显著，表明-20、-12 ℃对花粉活力的影响不明显，与保存时间的交互效应也不明显；保存90 d时，-20、-12 ℃对花粉活力的影响仍不显著，与保存时间的交互效应也不明显.由此进一步证实了-20、-12 ℃适于茵芋花粉的长期保存.

表4显示：0、4、6 ℃及室温下保存3 d的花粉活力差异显著，4 d后的花粉活力差异极显著；0、4、6 ℃及室温与保存时间的交互效应在13 d时才具有极显著差异，但对12 d内花粉活力的影响不显著.可见，茵芋花粉室温保存(临时保存)的适宜时间为12 d.

表5 0、4、6 ℃下茵芋花粉活力效应的方差分析1)Table 5 Variance analysis of the effect of 0,4, 6 ℃ storage on pollen vitality of S.reevesiana

1)**表示差异极显著(P<0.01)，*表示差异显著(P<0.05).

由于0、4、6 ℃及室温的保存环境明显不同，且0、4、6 ℃及室温保存对茵芋花粉活力的影响十分明显，进而对0、4、6 ℃下保存进行方差分析.结果(表5)显示，保存4 d 后，0、4、6 ℃对花粉活力的影响差异极显著，保存30～60 d的差异极显著.表明0、4、6 ℃对花粉活力的影响在30 d前不明显，显示花粉短期保存的适宜时间可初步辨断为30 d.保存温度与保存时间交互效应显著出现在30～60 d，表明0、4、6 ℃对花粉活力影响达到显著或极显著差异的保存时间为30～60 d,进一步证实花粉短期保存时间确定在30 d是合理的.另外，0、4、6 ℃下保存较室温下保存对花粉活力的影响达到极显著的时间间隔为17 d.

综上所述，-20、-12 ℃适于茵芋花粉90 d的长期保存，室温下临时保存的适宜时间为12 d， 0、4、6 ℃适用于短期保存且适宜保存时间为30 d.

3 小结与讨论

本试验首次探索了保存温度对茵芋花粉活力的影响，探明-20、-12、0、4、6 ℃及室温下保存的花粉活力随着保存时间的延长呈抛物线型下降，其拟合方程的相关系数分别为0.945、0.912、0.919、0.971、0.984、0.960.

本试验结果表明：茵芋花粉于-20、-12、0、4、6 ℃及室温下保存的活力在14 d时呈显著差异，此时的花粉活力分别为72.4%、67.7%、73.5%、69.7%、68.8%、34.1%，-20 ℃下保存的花粉活力是室温保存的2.12倍，显示不同保存温度对花粉活力的影响较大；0、4、6 ℃下保存的花粉活力在30 d时呈显著差异，-20、-12、0、4、6 ℃及室温下保存的花粉活力分别为64.9%、63.7%、69.8%、70.9%、46.9%、19.5%，4 ℃下保存的花粉活力是室温保存的3.64倍，同样显示了保存温度对花粉活力有明显影响；-20、-12 ℃下保存90 d时，保存温度与保存时间的交互效应均不显著，花粉保存90 d时仍分别具有63.8%、62.4%的活力，这两个温度对花粉活力的影响极小，显示了本试验研究的意义和价值.

本试验结果显示，-20、-12 ℃适用于茵芋花粉90 d的长期保存，90 d时的花粉活力仍分别达到63.8%、62.4%，且随着保存时间的延长其活力下降不明显，保存效果稳定.0、4、6 ℃适用于30 d内的短期保存，30 d时的花粉活力分别为69.8%、70.9%、46.9%；0、4、6 ℃下保存与保存时间交互效应显著的时间节点出现在30～60 d，这也进一步证实花粉短期保存的时间确定在30 d是合理的.室温保存仅适用于12 d内的临时保存，保存12 d时的花粉活力为57.9%，30 d时的花粉活力仅为19.5%.-20、-12 ℃下能够长期保存茵芋花粉，但生产实践的效用性稍差；0、4、6 ℃下保存在生产实践中的效用性较强，但仅适宜短期保存；30 d内的有效保存期，基本能够克服茵芋栽培中雌雄花期不遇的问题.因此，本试验划分的茵芋花粉长期保存、短期保存、临时保存策略，对指导茵芋栽培与开发具有指导意义.

茵芋花粉在6种温度下保存，对花粉活力的影响具有显著差异的时间节点分别出现在：3 d差异显著,4 d差异极显著(-20 ℃下保存); 7 d差异显著,8 d差异极显著(-12 ℃下保存);4 d差异显著,8 d差异极显著(0 ℃下保存);3 d差异不显著,4 d差异极显著(4 ℃下保存);10 d差异显著,11 d差异极显著(6 ℃下保存);6 d差异显著,7 d差异极显著(室温下保存).此结果与一般判断的时间节点(-20 ℃>-12 ℃>0 ℃>4 ℃>6 ℃>室温)有所异常.其成因可能是，-20、-12、0 ℃下保存的花粉，在冰冻与化冻的过程中结构被破坏，也可能是花粉含水量引发花粉的生理差异，以及统计学上的样本误差.但图7显示，-20、-12 ℃下随着保存时间的延长，花粉活力缓慢下降，-20 ℃的趋势线基本位于-12 ℃的上方且相互较接近，表明-20 ℃下保存的花粉生理代谢活动弱于-12 ℃下保存；同理，0、4、6 ℃及室温下保存，也由于保存温度引发花粉生理活性差异，从而使花粉活力出现较明显的差异.

茵芋花粉于-20、-12 ℃下保存，出现保存60 d时的花粉活力高于30 d的异常现象,具体原因有待进一步研究.前人研究也出现此现象，如白掌(Spathiphyllumkochii)花粉超低温保存也出现部分品种花粉活力随着保存时间的延长明显升高的现象[8]；芍药(RadixpaeoniaeAlba)花粉超低温保存后，部分品种出现花粉萌发率明显升高的“冷刺激”现象[9]，保存1年后的花粉活力超过保存前水平[10].

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