葡萄籽油超声辅助提取优化及脂肪酸成分分析

◎ 段亮亮

（陕西中医药大学公共卫生学院，陕西 咸阳 712046）

随着人们生活水平及品位的提高，葡萄酒工业迅速发展起来。葡萄籽为葡萄酒加工副产物，具有较大的开发价值，这主要由于葡萄籽中含有10%～20%的油脂[1]。葡萄籽油脂肪酸组成与大豆油相当，其中70%～90%的油脂为不饱和脂肪酸（unsaturated fatty acid，UFA），葡萄籽油由于较高的UFA含量，通常被用作高级保健油和营养油，用于肥胖、高血压患者的辅助治疗，及防止脑溢血等[2-3]。

超声波辅助提取（Ultrasonic-assistant extraction，UAE），常用实验室超声波清洗仪进行，与其他提取方法相比较，如超临界萃取和微波萃取。UAE存在许多优势，如试验设备操作方便，并且经济[4]。UAE提取组织中有机物的原理是基于提取时间的延长，细胞壁周围气泡吸收超声波的能量和热量，导致破裂，破坏细胞的结构。一旦细胞结构破坏，有机溶剂将渗透到细胞里，超声波穿过提取溶剂，促进细胞内有机成分的溶解和扩散[5]。这个过程中，有机物在提取剂里的溶解和扩散会受提取溶剂、提取时间、提取温度和提取功率的影响。这些因素是影响UAE效率的重要因素。因此，本次研究的目的主要是优化超声辅助提取各参数（提取溶剂、提取时间、提取温度和提取功率），以高效提取葡萄籽油脂，并检测其中的脂肪酸成分。

1 材料

1.1 试验材料

酿酒葡萄赤霞珠（Cabernet Sauvignon）乙醇发酵后，皮渣中分离所得葡萄籽清洗3次，放入烘箱，在55 ℃条件下干燥，烘至含水量＜2%，粉碎至粒径小于200目，备用。

1.2 试验仪器及试剂

仪器：高速粉碎机HY-04A，北京环亚天元机械技术有限公司；电热鼓风干燥箱DGG-101-3BS，天津市天宇实验仪器有限公司；超声波清洗器SG3200HBT，上海冠特超声仪器有限公司；旋转蒸发器RE-52AA，上海亚荣生化仪器厂；水浴锅XMT-DA，余桃市亚星仪器仪表有限公司；多功能氮吹仪TTL-DC，北京同泰联科技发展有限公司；6890NGC/5975BMS气相色谱与质谱联用仪，美国安杰伦公司。试剂：除甲醇和脂肪酸甲酯化衍生后提取溶剂己烷为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 超声波辅助提取赤霞珠果籽油

称量10 g样品于200 mL锥形瓶中，加入提取溶剂正己烷，铝箔封口，放至超声波仪中在设定条件下进行提取。提取完成后，真空旋转蒸发至溶剂基本挥发完，放入55 ℃的烘箱中烘干至恒重，并精确记录质量，重复3次，取均值。

果籽油提取率计算：提取率（%）=m1/m2×100%。式中：m1为葡萄籽油质量，g；m2为葡萄籽粉质量，g。

2.2 脂肪酸成分

10 mg葡萄籽油提取物中加入3 mL 1% H2SO4-CH3OH衍生化试剂，65 ℃条件下水浴衍生化2 h。加入2 mL己烷振摇30 s，加入5 mL蒸馏水分层萃取，选取上层溶液，萃取3次，无水Na2SO4过滤除水[6]。99.999%高纯氮吹至1 mL，0.45 μm滤膜过滤，进样分析脂肪酸成分。

2.3 GC-MS分析条件

毛细管柱型号：Agilent 19091N-136，HP-INNOWAX Polyethylene Glycol 60 m×0.25 mm ×0.25 μm（J&W scientific，USA）。采用程序升温：初温80 ℃，保持1 min，然后以25 ℃/min的速度升温至220 ℃，再以5 ℃/min的速度升温至250℃，保持20 min。不分流进样，进样量1 μL，载气99.999% He，流速1 mL/min。进样口温度：250 ℃。进样口压力：93.49 kPa。吹扫流量：55.9 mL/min。吹扫时间：0.75 min。总流量：63.9 mL/min。

质谱条件：质谱接口温度为280 ℃，离子源温度为230 ℃，四级杆温度150 ℃，电离方式EI，离子源能量70 eV，质量扫描范围为20～350 u。

定性和定量：结合各标准物质特征离子和出峰时间，采用NIST08谱库进行检索匹配定性，采用内标法进行定量，内标十九酸甲酯，浓度0.4 mg/mL。

2.4 数据分析与作图

采用SPASS 13.0数据处理软件对实验数据进行分析，Origin 8.0软件进行作图。

3 结果与分析

以葡萄果籽油提取率为考察指标，分析超声时间、料液比、超声功率、超声温度四个因素对葡萄籽中脂肪酸提取量的影响，确定最佳提取条件。

3.1 超声时间对葡萄籽油提取量的影响

准确称取6份水分含量＜2%的葡萄籽粉10 g，置于锥形瓶中，加入正己烷60 mL，用封口膜封口，放入超声波提取仪中，在28 ℃、264 W条件下，分别超声10、20、30、40、50、60 min，收集提取液，真空旋转蒸发至有机溶剂挥发完，55 ℃的烘箱中烘干至恒重，测定油脂提取率，重复3次，确定最佳超声时间。

由图1可知，提取时间小于30 min时，葡萄果籽油提取率随着时间的延长明显增大；当提取时间大于30 min时，油脂提取率趋于平缓，变化不显著，表明30 min后，随提取时间的延长对油脂提取率的影响不大，因此，超声提取时间最佳为30 min。

图1 超声时间对葡萄籽油提取率的影响图

3.2 超声功率对葡萄果籽油提取率的影响

样品中加入60 mL正己烷，在超声功率176、220、264、308、352、396 W条件下，28 ℃超声提取30 min，测定油脂提取率，重复3次，确定最佳超声功率。

由图2可知，超声功率设定在176～352 W时，随着功率的增大，超声波对细胞壁的破碎作用增强，胞内油脂溶出速率增大，溶液中葡萄籽油提取率也逐渐增大；在352～396 W时，随着超声功率的增大，油脂提取率没有明显变化。因此，超声波提取功率最佳为352 W。

图2 超声功率对葡萄籽油提取率的影响图

3.3 料液比对葡萄果籽油提取率的影响

分别加入料液比为1∶4、1∶6、1 ∶8、1 ∶10、1∶12、1∶14的正己烷，在超声功率352 W，超声温度28 ℃的条件下，超声提取30 min，测定葡萄籽油提取率，重复3次，确定最佳料液比。

由图3可知，料液比小于1∶8时，葡萄果籽油提取率随着料液比的增大明显增大；当料液比大于1∶8时，油脂提取率趋于平缓，没有明显的增大，表明料液比1∶8时能够实现葡萄籽油的充分提取。因此，料液比最佳为1∶8。

图3 料液比对葡萄籽油提取率的影响图

3.4 超声温度对葡萄果籽油提取率的影响

葡萄籽样品按照料液比为1∶8的比例加入正己烷，分别在20、28、36、44、52、60 ℃，352 W条件下超声提取30 min，测定葡萄籽油提取率，重复3次，确定最佳超声温度。

由图4可知，不同超声温度对葡萄籽油提取率具有一定影响，随着温度升高，提取率提高，当温度达到44 ℃后，葡萄籽油提取率没有明显增加，开始趋于平缓。这可能是因为油脂提取已趋于饱和，所以不再会随温度升高而增多。因此，44 ℃为最佳提取温度。

图4 超声温度对葡萄籽油提取率的影响图

3.5 葡萄籽油提取正交试验

结合单因素实验的结果，选取超声时间、超声功率、料液比、提取温度4个因素，每个因素4个水平，按L16（44）设计进行正交试验，因素与水平见表1。

表1 正交试验因素水平表

由表2极差分析结果表明，影响葡萄籽油提取率的因素主次顺序是料液比＞超声时间＞超声功率＞超声温度。从表3方差分析结果来看，料液比对葡萄籽中脂肪酸提取含量影响最为显著。由极差和方差分析综合得出，超声提取葡萄籽中脂肪酸的最佳工艺条件是A3B1C4D4，即超声时间为35 min，超声功率308 W，料液比为1∶8，超声温度为52 ℃。

表2 超声提取工艺正交试验结果表

表3 试验方差分析表

按上述最佳提取条件，进行3次平行实验，葡萄籽油得率分别为11.01%、11.07%、11.03%，平均值为11.04%，稳定性较好，说明正交试验结果正确可靠。每个样品重复提取3次，取其平均值得出赤霞珠葡萄籽油提取率为11.46%。

3.6 赤霞珠葡萄籽油脂肪酸分析

采用GC-MS对超声辅助提取最佳工艺条件下所得的葡萄籽油的脂肪酸组成与含量进行了测定。如图5所示，共检测出10种脂肪酸成分，其中以亚油酸（80.843%）、棕榈酸（7.283%）、油酸（8.057%）、硬脂酸（3.260%）为主，其次为亚麻酸（0.284%）、二十酸（0.150%）、十七酸（0.050%）、十四酸（0.044%）、棕榈油酸（0.027%）、十五酸（0.002%），该研究结果与以往研究基本一致[7]。

图5 葡萄籽油中定量脂肪酸含量图（mg/kg）

4 结语

超声提取葡萄籽中脂肪酸酯的最佳工艺条件是超声时间35 min，超声功率308 W，料液比为1∶8，超声温度为52 ℃，该条件下葡萄籽油提取率为11.46%，葡萄籽油中检出脂肪酸成分10种，主要成分为亚油酸、软脂酸、油酸、硬脂酸。

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