脯氨酸缓解酸性土壤上小白菜铝毒胁迫的效应及其潜在机制

吕 波，王宇函，姜存仓

（华中农业大学资源与环境学院，微量元素研究中心，武汉 430070）

我国以酸性土壤为主，铝（Al）毒是限制作物生长和减少产量的重要原因之一[1]。通常情况下，土壤中Al以难溶性或固定状态存在于土壤固相中，对植物不产生毒害作用，当土壤pH<5时，活性铝含量就随pH值降低而升高[2]，它们存在于土壤介质中，直接对植物产生胁迫作用。植物在Al胁迫下，其根尖结构遭破坏，根系伸长被抑制，根系活力降低[3]，Al胁迫阻碍植物对养分的吸收，降低其抵抗外界环境变化的能力，从而影响植物生长和作物产量[4]。脯氨酸（Pro）在植物体内水溶性较强，可以被植物快速吸收[5]，是植物体内最有效的渗透调节物质之一。有关研究表明，Pro可以提高油菜、水稻等作物产量[6]、抵御逆境胁迫过程[7]以及提高植物叶绿素的含量[8]；Pro还可促进植物对必需元素（如钙、镁等）的利用[9]，改善光合作用过程[10]，并提高代谢能力。植物在逆境条件下易产生活性氧，Pro可与活性氧结合，使植物免受伤害[11]。Pro还可作为重金属、低温、高温等逆境胁迫条件下植物的保护剂，提高植物抗氧化酶活性，增强植物抗逆性[12]。在逆境胁迫条件下可通过施用外源Pro来提高植物抗逆能力[13]。目前关于外源Pro缓解盐以及重金属等胁迫的研究很多[14-15]，但是对于外源Pro缓解Al胁迫的研究却鲜有报道。因此，本文研究了不同浓度外源Pro对Al胁迫下小白菜产量、生理特性的影响，为外源Pro对Al毒缓解的应用提供科学的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验于2017年3—5月在华中农业大学盆栽场进行，供试作物为小白菜“四月慢”。供试土壤为黄棕壤，取自校内大田耕层。土壤经自然风干后，除去石块及植物未腐烂残体后研磨过2 mm筛，混匀后备用。其基本理化性质：pH值5.2，有机质13.3 g·kg-1，全氮 0.81 g·kg-1，碱解氮 38.9 mg·kg-1，速效磷 49.2 mg·kg-1，速效钾 169.4 mg·kg-1，活性 Al 407.5 μg·g-1。

1.2 试验设计

本试验以土培盆栽的方式进行，设置T1（0外源Al+0外源Pro）、T2（外源Al）、T3（外源Al+10 mmol·L-1外源Pro）、T4（外源Al+20 mmol·L-1外源Pro）、T5（外源Al+50 mmol·L-1外源 Pro）5个处理，每个处理 4次重复。外源 Al为 AlCl3·6H2O（分子量为 241.43），微量元素用Arnon营养液配方（pH值为6.0）。取过2 mm筛的风干土样1.5 kg于盆中，称取底肥：NH4NO30.571 g·kg-1，KH2PO40.439 g·kg-1，KCl 0.141 g·kg-1，AlCl3·6H2O 0.242 g·kg-1。外源 Al和基肥按试验处理分别施入土壤且均匀混合。种子晾晒后浸泡于纯水中过夜（4℃），挑选饱满一致的种子于塑料盆中，每盆播种约20颗，分散距离均匀，在温室内培养至发芽，发芽后间苗培养，用不同浓度外源Pro溶液进行灌根处理，于2月28日播种，3月14日第一次处理，每7 d进行1次，每次用量50 mL，总共3次，T3、T4和T5外源Pro总施用量分别为每盆0.17、0.34 g和0.86 g，4月14日收获，期间每日浇水，运用重量差减法使水分维持约75%田间持水量，共培养45 d。

1.3 指标测定与方法

1.3.1 样品采集

收获时，调查小白菜株高等农艺性状，称取每盆产量（地上部可食部分鲜重），每盆随机取1株样品测定叶绿素、抗氧化酶以及丙二醛（MDA）等鲜样指标，所有样品在105℃下杀青30 min，60℃烘干称干重，把干样磨碎后供分析测试用。样品收获后，将不同处理的土样风干磨细并分别过20目和100目的筛子，土样用自封袋保存供分析测试用。

1.3.2 植物样品测定

采用乙醇比色法[16]测定植物叶片叶绿素含量；采用愈创木酚法[16]测定过氧化物酶（POD）活性；采用NBT还原法[16]测定超氧化物歧化酶（SOD）活性；采用紫外分光光度法[16]测定过氧化氢酶（CAT）活性；采用硫代巴比妥反应法[16]测定MDA含量；采用浓H2SO4-H2O2消煮，蒸馏定氮法测定植株氮含量[17]，钼锑抗比色法测定植株磷含量[17]、火焰光度法测定植株钾含量[17]。采用硝酸和高氯酸混酸消解-石墨炉原子吸收分光光度法[18]测定植物叶片Al含量。

1.3.3 土壤基本理化性质测定

土壤样品用于测定收获后土壤的基本理化性质以及土壤的活性Al含量。土壤基本理化性质参照鲍士旦[17]编制的《土壤农化分析》测定：使用pH计测定土壤 pH 值（土水比 1∶2.5），10.0 g土+25.0 mL 水；碱解扩散法测定土壤碱解氮；NH4OAc浸提，火焰光度法测定土壤速效钾；0.5 mol·L-1NaHCO3浸提，钼锑抗比色法测定土壤有效磷；用庞叔薇等[19]提出的浸提方法测定土壤活性Al的含量。

1.4 数据处理与分析

试验公式[20]：

养分积累量=养分含量×植株干物质积累量。

采用Excel 2010对数据进行处理分析和作图。用SAS进行单因素方差分析，t检验差异显著性水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 外源Pro对Al胁迫下小白菜产量的影响

从表1可知，相对于T1，单施Al使小白菜产量、干重和株高显著降低，株高和产量分别减少了9.2%和10.6%，均达到显著水平；Al胁迫下，不同浓度外源Pro使小白菜株高、产量和干重显著增大，株高分别提高了17.8%、25.4%和14.4%，产量分别升高了28.4%、38.4%和65.2%。Al胁迫下，不同浓度外源Pro处理的产量相对于T1均增加，且有逐渐升高的趋势，其中50 mmol·L-1外源Pro处理产量最高，提高了约37.1%。因此说明外源Pro具有缓解Al对小白菜生长胁迫和提高小白菜产量的作用。

2.2 外源Pro对Al胁迫下小白菜养分含量和积累量的影响

从表2得出，相对于T1，Al胁迫下小白菜的氮、磷、钾含量明显降低，分别减少了28.2%、40.9%和13.1%，养分总积累量分别降低了45.5%、55.2%和34.0%，均达到显著水平，Al对小白菜养分吸收产生抑制作用。Al胁迫下施加不同浓度外源Pro，小白菜的氮、磷、钾含量均明显上升，且随着Pro浓度的升高，养分含量呈现逐渐升高的趋势，浓度为50 mmol·L-1时养分含量最高，相对于T2氮、磷、钾含量分别增加了60.7%、50.0%和23.2%；此外，小白菜养分总积累量明显增加，缓解Al对小白菜的抑制作用，其中50 mmol·L-1缓解效果最好，相对于 T2氮、磷、钾总积累量分别增加了169.4%、151.6%和106.6%。因此，外源Pro可缓解Al对小白菜养分吸收的抑制，促进小白菜对养分的积累。

表1 外源Pro对Al胁迫下小白菜产量的影响Table 1 Exogenousproline effect on thegrowth of pakchoi under aluminumstress

2.3 外源Pro对Al胁迫下小白菜叶片Al含量的影响

从图1得出，Al胁迫下小白菜叶片Al含量相对于T1显著提高了24.3%，施加外源Pro后，小白菜叶片Al含量显著降低，分别降低了20.4%、45.6%和49.8%，说明外源Pro可减少小白菜对Al的吸收，缓解Al胁迫作用。随着外源Pro浓度升高，小白菜叶片Al含量呈现逐渐降低的趋势，且均低于T1水平，其中50 mmol·L-1外源Pro缓解效果较好。

表2 外源Pro对Al胁迫下小白菜养分含量和积累量的影响Table 2 Exogenousproline effect on the nutrient content and accumulation of pakchoiunder aluminumstress

图1 外源Pro对Al胁迫下小白菜叶片Al含量的影响Figure1 Exogenous proline effect on the content of aluminumin pakchoileaves under aluminumstress

2.4 外源Pro对Al胁迫下小白菜叶绿素的影响

如表3所示，Al会减少叶绿素含量，破坏小白菜叶片的叶绿素。相对于T1，T2处理的小白菜叶片叶绿素受到破坏，叶绿素a含量减少17.3%，叶绿素b减少27.2%，类胡萝卜素含量减少29.0%，且均达到显著水平；Al胁迫下施加不同浓度外源 Pro 后，T3、T4、T5处理叶绿素含量均相应地增加，随着外源Pro浓度升高，叶绿素含量呈现递增趋势，其中50 mmol·L-1外源Pro的缓解效果较好，叶绿素a、b和类胡萝卜素含量分别提高了29.1%、38.9%和36.4%。外源Pro对Al胁迫下小白菜叶片叶绿素含量产生了一定的影响，但并未显著提高，只是缓解并逐渐恢复到T1水平。

表3 外源Pro对Al胁迫下小白菜叶片叶绿素的影响Table3 Exogenousprolineeffect on chlorophyll in leavesof pakchoiunder aluminumstress

2.5 外源Pro对Al胁迫下小白菜抗氧化酶活性和MDA含量的影响

从表 4 得知，相对于 T1，添加外源 Al，POD、SOD和 CAT活性分别降低了 13.7%、21.1%和 30.4%，MDA含量显著升高了58.8%；Al胁迫下，不同浓度外源Pro使抗氧化酶活性显著提高，MDA含量显著降低，其中50 mmol·L-1效果最好，POD活性提高了24.3%，SOD活性升高了266.9%，CAT活性提高了142.6%，MDA含量降低了40.8%。随着外源Pro浓度升高，POD、SOD和CAT活性呈现逐渐升高的趋势，最终均比T1水平高，说明外源Pro可减弱Al对抗氧化酶活性的影响。因此，外源Pro可增强抗氧化酶活性来缓解Al胁迫。

2.6 外源Pro对Al胁迫下土壤pH值和活性Al含量的影响

图2 外源Pro对Al胁迫下土壤pH值和活性Al含量的影响Figure 2 Exogenousproline effect on soil pH and available Al content under aluminumstress

表4 外源Pro对Al胁迫下小白菜抗氧化酶活性和MDA含量的影响Table 4 Exogenous proline effect on antioxidant enzyme activity and MDA content in pakchoiunder aluminumstress

从图2可得出，相对于T1，外源Al使土壤pH值由5.65减少为4.90，降低了0.75个单位，达到显著水平，施加不同浓度外源Pro后，土壤pH值并未明显改善，未达到显著水平，说明外源Pro对Al胁迫下土壤pH值的影响不大。T1土壤活性Al含量为456.02μg·g-1，T2土壤活性 Al含量为 525.86 μg·g-1，本试验外源Al施加量为 27 μg·g-1，增加量为 69.84 μg·g-1，增加量大于施加量；施加外源Pro后，土壤活性Al含量分别降低了4.3%、24.5%和19.7%。外源Al使土壤pH值降低，活性Al含量升高，说明土壤pH值降低对活性Al含量升高有一定的影响；添加外源Pro后，土壤pH值未明显变化，但土壤活性Al含量显著降低，说明外源Pro对Al胁迫下土壤活性Al含量的影响并不是通过调节土壤pH值实现的。

3 讨论

3.1 外源Pro对Al胁迫下小白菜生长及生理特性的影响

植物在生长过程中需要适宜的土壤环境，但实际上土壤环境中存在着很多限制作物生长的因素，如土壤pH值降低、活性Al含量过多导致的Al毒[4]等。Al毒对植物生长发育的影响主要表现为根系吸收养分受到阻碍、生长受到抑制、产量降低等[21]。本试验发现，在黄棕壤中施加外源Al后，土壤pH值下降了0.75个单位，小白菜的氮、磷、钾含量分别减少了28.2%、40.9%和13.1%，养分总积累量分别降低了45.5%、55.2%和34.0%，小白菜株高降低了9.2%，产量减少了10.6%，说明土壤pH值降低是Al胁迫下小白菜产量下降和生长发育受限制的重要原因之一。

有研究[22]表明，逆境胁迫下，植物易产生活性氧，直接对植物的生理特性产生影响。植物体内与活性氧消除有关的酶活性在逆境胁迫下一般会增强，从而植物抗氧化能力得到提高。Okuma等[23]发现10 mmol·L-1Pro促进悬浮培养烟草细胞的生长；Hoque等[24]发现Pro可提高植物叶片抗氧化酶活性。本研究发现，外源Al使POD、SOD和CAT的活性显著降低，分别降低了13.7%、21.1%和30.4%，使膜脂过氧化产物MDA含量显著升高，升高了58.8%，对小白菜的抗氧化酶系统造成损害，施加不同浓度外源Pro后，促进小白菜SOD、POD和CAT活性，减少MDA在体内的积累，从而减轻膜脂过氧化程度和增强抗氧化能力。外源Pro缓解Al胁迫的原因可能在于作为活性氧消除剂，激发体内POD、SOD以及CAT的活性，降低活性氧对植物的危害，增强小白菜抵抗逆境的能力，Anjum等[25]研究也证实了这一点。除此之外，Ashraf等[26]研究认为外源Pro缓解逆境胁迫效果取决于作物的类型以及Pro的浓度等，适宜Pro浓度可能在5~60 mmol·L-1之间[27-28]。本试验设置3个浓度，综合数据发现在提高产量、抗氧化酶活性、叶绿素含量和养分总积累量以及降低MDA含量、植物叶片Al含量和土壤活性Al含量等方面，浓度为50 mmol·L-1时缓解效果较好，此浓度在研究范围之内。

3.2 外源Pro及外源Al对小白菜和土壤Al含量的影响

本试验中，外源Al的施入使得土壤活性Al含量增加，土壤活性Al含量从456.02μg·g-1增加到了525.86 μg·g-1，增加量为 69.84 μg·g-1，大于施加量 27 μg·g-1，说明外源Al可使土壤固定态Al转化成活性Al，这与应介官等[29]研究生物炭及外源Al对土壤Al含量试验结果相似。除此之外，施加不同浓度外源Pro后，小白菜和土壤中的Al含量加上外源Al的施入量，T2~T54个处理Al总量呈现下降的趋势。有研究[30-31]表明，土壤活性Al含量与土壤pH值有密切关系，当土壤pH<5时，土壤活性Al含量随pH值降低而升高，但在本实验中，外源Pro并没有显著提高土壤pH值，因此降低土壤和植物中Al含量并不是通过提高土壤pH值来实现的，对此Bolan等[32]研究发现有机酸可以与活性Al形成对植物无害的稳定物质，宋敏等[21]的研究也证实外源Pro可与自由金属离子形成无毒的金属-Pro复合物，减轻金属对植物抗氧化酶活性以及光合中心离子的毒害作用。因此本试验主要原因可能在于外源Pro与土壤活性Al相结合使土壤活性Al转化成Al-Pro稳定复合物，外源Pro被植物吸入体内直接转化成内源Pro与体内Al形成某种稳定物质[21]，且这两种物质对植物没有危害，从而同时降低了土壤和小白菜中Al含量，这也解释了总体下降趋势的问题。

3.3 外源Pro的应用前景

Pro是一种可溶性的渗透调节物质，中性条件下不带电，具有分子量低、水溶性高等特点[33-34]。Pro性质稳定，可在常温和常压条件下稳定存在。Pro对植物具有两方面积极作用，充当逆境调节物质和能量[35-36]：植物在逆境胁迫条件下，Pro可以与胁迫条件产生的氧自由基发生反应转变为无害物质，消除活性氧危害；当植物从胁迫条件恢复正常时，Pro降解产生能量，可作为氮、磷的快速补偿能源。目前关于Pro的研究很多，主要倾向于其在植物体内的抗逆机制[37]，多应用于缓解干旱、高温、盐胁迫和重金属等[38]逆境胁迫，但是目前有关Pro功能和植物抗逆性的研究都是在培养室中进行的，在野外条件下还没得到成功的验证[13]。Pro由于其高水溶性可作为水溶肥施用，成本较低，为新型肥料研究提供新的思路。

4 结论

（1）外源Al使土壤pH值降低，土壤活性Al含量增加，植物体内Al含量升高，抗氧化酶活性减弱，膜脂过氧化程度增强，叶绿素破坏，养分总积累量减少，Al对小白菜生长产生胁迫作用。

（2）Al胁迫下施用不同浓度外源Pro未明显提高土壤pH值，可使土壤活性Al含量下降，植物体内Al含量下降，抗氧化酶活性提高，膜脂过氧化程度减弱，叶绿素恢复到正常水平，养分总积累量增加。外源Pro有效地缓解了Al对小白菜生长的抑制，且50 mmol·L-1外源Pro对Al胁迫缓解效果较好。

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