基于rDNA-ITS和组蛋白3基因序列分析鉴定新疆棉花叶斑病病原

李映程 ，张国丽 ，任毓忠 ，李海强 ，武刚 ，李天义 ，李国英 *，张莉 *

(1.石河子大学农学院/新疆绿洲农业病虫害治理与植保资源利用自治区高校重点实验室，新疆石河子832003；2.新疆农垦科学院生物技术研究所，新疆石河子832000；3.新疆农业科学院植物保护研究所，乌鲁木齐830000；4.新疆生产建设兵团第一师农业科学研究所，新疆阿拉尔843300；5.新疆塔里木河种业股份有限公司，新疆阿拉尔843300）

棉花叶斑病在世界各大植棉区普遍发生，也是我国棉花上的1种常见病害，其中链格孢菌（Alternariaspp.）是引起叶斑病的1类重要病原。但各地报道引起叶斑病的链格孢菌种类存在较大差异。Sciumbato等[1]1972年报道印度棉花轮纹斑病是由Alternaria macrospora引起的。在美国密苏里州（Missouri）、路易斯安那州（Louisiana）以及以色列，该病也是由A.macrospora造成的；原苏联棉区发生的叶斑病主要由大孢链格孢（A.macrospora）和棉链格孢菌（A.gossypina）引起[2]；Palmateer等2000年和2001年调查美国亚拉巴马州（Alabama）陆地棉叶斑病，最常见的病原为A.alternata[3]。我国棉花轮纹斑病病原以大孢链格孢（A.macrocpora）、细极链格孢（A.tenuissima）和棉链格孢（A.gossypina）等为常见种，最常见的为大孢链格孢（A.macrospora）[4-5]。张文蔚等从北京、天津、新疆、山东、河北、河南、江苏等地采集17份叶斑病样品鉴定，16份为A.alternata，只有1份从天津棉田采集的为A.macrospora[6]。陈凯等鉴定河南省洛阳市、三门峡市、周口市和河南省农业科学院棉田（郑州市）发生的棉花叶斑病由A.tenuissima引起[7]。

新疆是我国最大的棉区，属典型的大陆性气候，春季常有明显的倒春寒，秋季降温快，是我国棉花叶斑病的常发区[8]，但对其病原尚未进行较为系统的调查和鉴定，为此开展了本研究。

1 材料与方法

1.1 病害调查、病样采集及症状描述

2016年在棉花苗期和中后期，棉花叶斑病分别在石河子和阿克苏植棉区大发生。为此于2016年和2017年，以北疆石河子和南疆阿克苏（主要种植陆地棉，也种植长绒棉）为主，分别对北疆石河子、昌吉、博乐、阿勒泰和南疆阿克苏、喀什、和田等7个地区30个地点的棉花叶斑病发生情况进行了调查，并采集典型症状的病样206份，供分离鉴定。同时对田间症状和接种后的症状进行现场观察和描述。

1.2 病原分离、纯化及代表性菌株的选择

采用常规组织分离法，即将所采病样经流水冲洗后，从病健交界处剪取4～5 mm2的组织块，用0.1%（质量分数）升汞消毒5～10 s，无菌水漂洗3次后，用无菌吸水纸吸干表面水分，置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基 （Potato dextrose agar medium，PDA）上，25℃恒温培养 2 d后，挑取菌落边缘菌丝进行纯化；并根据病样采集时间、地点、分离菌株的数量及菌落的培养特征，按南疆、北疆分苗期（5―6月份采样）和生长中后期（主要在8―9月份，个别在7月上旬采样），各选取10个代表性菌株（共40个代表性菌株），4℃保存在PDA上，供鉴定用。

1.3 病原致病性测定

采用离体叶片接种法。采集植株相同部位的健康叶片，清洗干净，用75%（体积分数）酒精轻轻擦拭叶片表面，消除杂菌，4℃处理24 h后供接种用。接种前用少量无菌水洗下在PDA上培养7 d的分生孢子，用血球计数板按常规方法配制每毫升1×107个分生孢子的悬浮液，采用喷雾法进行接种，重复3次，以无菌水为对照。接种结束后，将其置于12 cm×12 cm、垫有湿润无菌滤纸的发芽盒中，放入白天18℃、夜间12℃的智能光照培养箱中，定期观察并记录发病情况。发病后，观察其症状并进行分离和镜检，明确与原接种菌的异同。

1.4 病原鉴定

1.4.1形态学鉴定。用刀片直接刮取病斑处的分生孢子，观察其形态、颜色并记录分生孢子的纵横膈膜数，测量50个分生孢子的大小。挑取纯化后的供试菌株在PDA上培养5 d，观察并描述菌落形态和颜色。采用常规玻片培养法，25℃下培养5 d，观察、记录其分生孢子的着生状态并拍照，作为病原鉴定的主要形态学依据，参照《中国真菌志》（第十六卷）链格孢属[9]对病原进行鉴定。

1.4.2分子生物学鉴定。用灭菌刀片刮取在PDA上25℃培养7 d的各供试菌株的菌丝体。用BioFlux试剂盒提取供试菌株的基因组DNA。参照Kusaba等[10]和王洪凯等[11]报道，用真菌内转录间隔区（Internal transcribed spacer，ITS）通用引物[ITS1 （5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'），由上海生物工程股份有限公司合成]进行聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR），反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性50 s，56℃退火40 s，72℃延伸1 min，共35个循环；最后72℃延伸10 min，反应体系为 25 μL；参照王泰云等[12]、杨超等[13]的报道，用组蛋白3基因扩增引物[H3-1a（5'-ACTAAGCAGACCGCCCGCAGG-3'）和H3-1b（5'-GCGGGCGAGCTGGATGTCCTT-3'），由上海生物工程股份有限公司合成]进行PCR，反应程序：96℃预变性 2 min；96℃变性 15 s，55℃退火30 s，75℃延伸 35 s，共 30个循环；最后 72℃延伸 2 min，反应体系为 25 μL。

2对引物的PCR扩增产物，分别用1%（质量分数）的琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像仪上观察并拍照。在ZF-90型多功能暗箱式紫外透射仪下切取目的片段，使用全式金凝胶回收试剂盒（Easy Pure Quick Gel Extraction Kit）回收目的片段。纯化后与pMD19-T载体连接，转入大肠杆菌DH5α。PCR检测筛选阳性克隆，送到上海生物工程有限公司测序。

测序结果在NCBI上进行Blast比对，应用MEGA 5.0软件中的临近法（Neighbor-Joining，NJ）构建病原系统发育树，分析菌株间的亲缘关系，确定病原分类地位。

2 结果与分析

2.1 棉花叶斑病发病情况的调查和症状描述

2016年和2017年在南北疆植棉区调查发现，该病在新疆整个生长期虽然都可发生，但主要在棉花苗期和生长后期发生较重。不同时期、不同年份和不同地区间发病情况有较大差异。如2016年春季，北疆棉区由于持续低温多雨，棉花苗期叶斑病大发生，发病率高达100%，明显抑制幼苗生长和发育；8月下旬南疆阿克苏地区遭遇冰雹，之后叶斑病大发生，不少棉田棉花一片枯焦，严重影响产量。2017年由于苗期和生长后期气候比较正常，该病发生相对较轻。

无论是陆地棉还是长绒棉，苗期子叶、真叶均可发病，发病初期子叶和真叶上均产生紫红色或褐色、中部稍凹陷的小型斑点，后逐渐扩大成外缘红褐色或褐色、圆形或不规则形、直径2～3 mm的病斑，严重时病斑彼此连接成片，形成大型的褐色枯死斑，导致叶片焦枯、脱落。生长后期发病的症状和苗期基本相同，均主要为害叶片产生叶斑，典型的轮纹很少，只有在条件非常有利发病的情况下才会出现。据在阿克苏地区调查，该病在长绒棉上发生一般重于陆地棉，在长绒棉上不仅感染叶片，还感染苞叶，并在茎秆上产生细长的梭状条斑。

供试菌株接种后的症状和田间症状相同，主要在叶片产生斑点，极少产生典型的轮纹。

2.2 病原分离及代表性菌株的选择

从南疆、北疆所采集的206份典型叶斑病样中，成功分离出180个链格孢属（Alternariaspp.）菌株，分离率达87.4%。选取40个代表性菌株供病原鉴定。其中，1～20号为北疆病样（1～10为苗期，11～20为生长中后期），21～40为南疆病样（21～30为苗期，31～40为生长中后期）。具体情况见表1。

2.3 病原致病性测定

室内接种5 d后，叶片开始出现黑褐色斑点，症状与自然病害症状相似，40个代表性菌株均会引起叶片发病，对照组棉花叶片则未出现症状。从发病组织中再次分离的菌株与原接种菌形态特征一致。根据柯赫氏法则，40个代表性菌株均具有致病性。

2.4 病原鉴定

2.4.1形态学鉴定。经形态观察，初步可将供试菌株分为3类。第1类包括1～6、19和20号，共8个菌株，在PDA培养基上培养，初期菌落灰白色，后期中央略微隆起，褐色或深褐色，毛毡状，基质浅褐色至褐色。分生孢子梗单生或簇生，直立或弯曲；分生孢子单生或2～11个串生，具3～7个横膈，2～4个纵膈或斜膈，大小（12.5～35.0）μm×（5.0～12.5）μm，黄褐色或褐色，棒形、倒梨形；有喙或无喙，喙锥形或短柱状，（2.0～12.5）μm×（1.5～4.5）μm。 初步鉴定为A.alternata（图1 A1、A2、A3）。

第2类包括 7～10、12～18、21～30 和31～36号，共27个菌株，其形态和第1类比较相似，在PDA培养基上培养，菌落初期灰白色，后期中央略微隆起，灰白色至深灰绿色或深橄榄绿色，绒毛状，基质浅褐色至褐色。分生孢子梗单生或簇生，直立或曲膝状弯曲；分生孢子倒棍棒形、卵圆形或近椭圆形，淡褐色至暗褐色，单生或7～15个串生，具4～7个横膈，2～7个纵膈或斜膈，大小 （17.5～50.0）μm×（5.0～15.5）μm； 有喙或无喙，喙锥形或短柱状，大小 （2.5～15.0）μm×（2.5～4.5）μm。 初步鉴定为A.tenuissima（图 1 B1、B2、B3）。

表1 菌株样品编号及来源Table 1 Number and source of strain samples

表1（续）Table 1 (Continued)

图1 链格孢（A1、A2、A3）、细极链格孢（B1、B2、B3）和大孢链格孢（C1、C2、C3）菌落、分生孢子及着生方式Fig.1 Colonies,sub spore and the mode of production ofA.alternata(A1,A2,A3),A.tenuissima(B1,B2,B3)and A.macrospora (C1,C2,C3)

第3类包括11和37～40号，共5个菌株，其孢子形态和着生方式和前2类有明显区别。在PDA培养基上培养，菌落初期灰白色，后期中央略微隆起，灰褐色，绒毛状，基质褐色或深橄榄绿色。分生孢子梗单生或簇生，直或弯曲；分生孢子多单生或少数2个串生，具6～10个横膈，1～6个纵膈或斜膈，大小（49.8～110.6）μm×（15.0～40.3）μm；顶端有细长的喙，喙浅褐色至近无色，长度超过孢子的一半，大小（30.5～135.0）μm×（2.0～4.5）μm。 初步鉴定为A.macrospora（图 1 C1、C2、C3）。

2.4.2分子生物学鉴定。采用真菌通用引物ITS1/ITS4对病原基因组DNA进行扩增，11号和37～40号菌株扩增出582 bp的片段，剩余其他35个菌株扩增出 569 bp的片段 （图 2），经BLAST比对，11号和37～40号菌株序列与Gen-Bank中A.macrospora（登录号AY154689.1和DQ156342.1）同源性达99%。而其他菌株与A.al-ternata（登 录 号 KT384278.1、KY814634.1、KY788019.1和MG195995.1）的同源性达100%，与A.tenuissima（登录号 KF280456.1、KY788031.1、KT384277.1和MG250391.1）的同源性也达100%，无法确定其归属。因此，结合病原形态学特征，确认11号和37～40号菌株为A.macrospora。

图2 供试病原菌ITS区PCR扩增Fig.2 The results of the PCR of pathogen’s ITS

通过构建系统进化树发现，分析rDNA-ITS区序列，可以将大孢子种A.macrospora与小孢子种中的A.alternata和A.tenuissima区分，但无法将小孢子种A.alternata和A.tenuissima区分（图 3）。

采用组蛋白3基因扩增引物H3-1a/H3-1b对病原基因组DNA进行扩增，1～6号和19号菌株扩增出494 bp的片段，20号菌株扩增440 bp的片段，7～10号、11～18号、21～30号和 31～40号菌株扩增出 546 bp的片段 （图 4）。经BLAST比对显示，1～6号和19号与A.alternata（AF404620、KF997067 和 KR866858） 相似性达99%；20 号菌株与A.alternata（KF280540.1）相似性达 100%；7～10号、12～18号、21～30号和31～36号菌株与A.tenuissima（KT384348.1）相似 性 达 99%， 与A.tenuissima（KT384290.1、KT384354.1和KP267539.1）相似性达100%；而11号和37～40号菌株与A.alternata和A.tenuissima相似性都很高，说明组蛋白3基因扩增引物H3-1a/H3-1b，不能准确区分大孢子种和小孢子种。

由此，根据病原菌形态学特征，结合分子生物学鉴定，确认7～10号、12～18号、21～30号和 31～36 号菌株为A.tenuissima，1～6 号、19 号和20号菌株为A.alternata。

通过构建系统进化树发现，分析组蛋白3基因序列，很容易将小孢子种A.alternata和A.tenuissima分为2个类群，所有供试菌株与A.macrospora都不聚在一起（图 5）。

由此确认，此次采样的新疆棉花叶斑病的病原种类有3种，即A.alternata、A.tenuissima和A.macrospora，但各地链格孢属病原菌的种类有一定差别（表2），与内地报道的棉花叶斑病的病原种类也不完全相同[4-7]。

3 结论与讨论

经调查，棉花叶斑病在新疆棉花整个生长期都可发生，但主要发生在苗期和生长后期，此时如遇持续低温高湿的环境，则叶斑病发生较重。如2016年北疆春季遇持续低温高湿，苗期叶斑病发病率达100%，严重影响棉苗生长和发育；当年8月下旬后南疆阿克苏地区持续低温高湿，后期叶斑病大发生，不论是长绒棉还是陆地棉，都有不少棉田一片枯焦。正常气候条件下，该病在棉花生长中期很少发生；但若此时遇持续低温高湿的环境，特别是下冰雹之后，也会较重发生。如2016年6月末博州81团下冰雹之后，凡遭冰雹危害的棉花也发生较重的叶斑病。这种情况与新疆气候变化比较剧烈、春季常有明显的倒春寒、秋季降温快等因素有关。

图3 供试病原菌与相似种的ITS序列的发育树Fig.3 Dendrogram of ITS sequences of the pathogen and its related species

以形态学鉴定为基础，结合rDNA-ITS和组蛋白3基因序列分析，确定新疆棉花叶斑病的病原有 3种， 即A.alternata、A.tenuissima和A.macrospora，没有分离到棉链格孢A.gossypina。其中：北疆苗期（5―6月）棉花叶斑病的主要病原为A.alternata，占供测菌株的60%，次为A.tenuissima，占供测菌株的40%；生长后期（8―9月）棉花叶斑病的主要病原为A.tenuissima，占供测菌株的70%，次为A.alternata和A.macrospora，分别占供测菌株的20%和10%。南疆棉花苗期叶斑病的主要病原为A.tenuissima，占供测菌株的100%。南疆生长后期主要病原为A.tenuissima和A.macrospora，分别占供测菌株的60%和40%；其中，3个长绒棉品种上的病样（37～39号）病原全是A.macrospora，故生长后期长绒棉叶斑病的病原可能以A.macrospora为主，陆地棉以A.tenuissima为主，有待继续研究。

近年来研究证明，链格孢属级特征明显，种级特征变异较大，特别是链格孢属中小孢子组的成员，仅根据形态特征进行种的鉴定比较困难；因此，分子生物学方法越来越多地被应用。rDNA ITS区域介于18S rDNA、5.8S rDNA和 28S rDNA之间，进化速度较编码区快，可以为种间或种内的分子系统研究提供足够多的变异[14]。本研究基于rDNA-ITS可有效区分大孢子种A.macrospora与小孢子种A.alternata和A.tenuissima，而对于rDNA-ITS同源性超过98%的小孢子种A.alternata和A.tenuissima，通过分析组蛋白3基因序列可以较好地辨别。这与Wang等[12]、杨超等[13]研究结果一致。另外，新疆地域广阔，本研究采样点南疆以阿克苏为主，北疆以石河子为主，其他植棉区的叶斑病采样相对较少，且长绒棉叶斑病的采样也较少。因此，今后进一步研究时应注意合理确定采样地域及其分布。

图4 供试病原菌组蛋白H3基因PCR扩增

图5 供试病原菌与相似种组蛋白3基因序列的发育树Fig.5 Dendrogram of histone 3 gene sequences of the pathogen and its related species

表2 3种病原菌在南疆、北疆棉花苗期和成株期所占比例Table 2 Proportion of three pathogenic bacteria at the seedling and adult stage of cotton in Northern and Southern Xinjiang

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