黄酒生产过程中细菌群落结构与生物胺含量变化分析

陈历水，沈雪梅，刘蕾，张明，郑晓卫，杨海莺，*，王冶，赵洪一，陈博

（1.中粮营养健康研究院，北京102209；2.营养健康与食品安全北京市重点实验室，北京102209；3.老年营养食品研究北京市工程实验室，北京102209；4.邵阳学院，湖南邵阳422200；5.北京工商大学食品学院，北京 100048）

黄酒是我国的传统发酵食品，富含多种氨基酸和功能成分，营养丰富，与啤酒、葡萄酒并称世界三大古酒[1]。通常以糯米为原料，经浸米、蒸煮、加曲、糖化发酵、压榨、过滤、煎酒、贮存、勾兑而成。在酒的生产过程中，小曲（酒药）和麦曲中含有的多种微生物，包括细菌、酵母和霉菌等在酿造的不同阶段发挥着重要作用[2－3]。生物胺（Biogenic amines，BA）是黄酒在发酵过程中产生的一类低分子量含氮有机化合物，有研究发现过量外源生物胺的摄入会引起血管、动脉和微血管的扩大，导致生物体的不良反应，如高血压、头疼，腹部痉挛、腹泻和呕吐等[4]。饮用含有过量生物胺的发酵法生产的酒精类产品，如黄酒就会产生此类反应[5]。由于黄酒发酵是糖化、酵母发酵与乳酸杆菌发酵同时协同进行的三边发酵[6]。发酵酒醪中的乳酸杆菌主要是从外界环境的微生物菌群和发酵用米带入[7]，而且在酒醪发酵过程中，65%的杂菌是乳酸杆菌[8]。发酵过程中，曲霉分泌的蛋白酶和羧肽酶作用于蒸煮后原料米中的蛋白质，产生的氨基酸或寡肽为生物胺的形成提供了丰富的前体[9]，加上乳酸杆菌生长旺盛，将会造成生物胺的大量生成。因此，了解黄酒生产过程中菌群结构变化有助于生物胺含量的控制[10]。

本文以黄酒原米、小曲、麦曲以及发酵过程中的发酵液为研究对象，采用Illumina Miseq测序平台对细菌的16S rRNA序列V3－V4区进行测序分析，研究黄酒麦曲及其发酵过程中细菌组成及变化，并对其产生的生物胺含量进行分析，旨在揭示黄酒发酵中细菌群落结构与生物胺含量的关系，为黄酒的酿酒工艺优化及安全生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄酒用原米，黄酒酒药（小曲）、黄酒麦曲、生产过程中的黄酒样品（包括落缸、前酵、后酵、压榨、清酒和煎酒后样品）：中粮绍兴酒有限公司。样品采集完后立即于－80℃保存，备用。

DNA 提取试剂盒、KOD 酶、引物、Marker：上海生工生物工程有限公司；PCR产物Axy PrepDNA凝胶回收试剂盒：AXYGEN 公司；Quant－iTPicoGreen 荧光定量试剂盒：美国Life Technologies公司；TruSeq DNA建库试剂盒、MiSeq上机试剂盒：美国Illumina公司。

1.2 仪器与设备

5810R台式高速冷冻离心机：德国Eppendorf公司；ABI GeneAmp®9700型PC仪：美国ABI公司；DYY－12型电泳仪：北京六一仪器厂；UVPCDS－8000凝胶成像分析系统：美国伯乐公司；SpectraMax M5酶标仪：美国Molecular Device公司；Miseq基因组测序仪：美国 Illumina公司；蓝色荧光定量系统：美国Promega公司。

1.3 方法

1.3.1 生物胺测定

测定方法参照GB/T 5009.208－2008《食品中生物胺含量的测定》。

1.3.2 小曲、麦曲及生产过程中黄酒样品中细菌群落结构测定

1.3.2.1 总 DNA 提取

以提取的总DNA为模板，采用上游引物338F（ACTCCTACGGGAG GCAGCA） 和下游引物 806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT），进行 16S rRNA的V3－V4区域扩增。PCR采用Trans Start Fast Pfu DNA聚合酶（TransGen Biotech），反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 45 s，30个周期；72℃延伸10min。扩增后PCR产物使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒切胶回收，Tris－HCl洗脱；2%琼脂糖电泳检测。

1.3.2.2 文库构建和上机测序使用

根据电泳结果，对PCR产物进行定量分析，之后按照比例调整到相同浓度，用于构建文库。采用MiSeq平台双端PE300测序策略，使用上机试剂盒将文库加入Miseq测序仪进行测序。

1.3.3 生物信息学分析和数据分析

同一阶段的样品数不少于3个。针对黄酒数据，对原始数据进行过滤拼接处理后，得到优化序列。然后在97%的相似水平下，利用Usearch（vsesion 7.1 http：//drive5.com/uparse/）软件平台，划分可操作分类单元（Operational Taxonomic Units，OTU），并挑取 OTU的代表序列[11]。采用RDP classifier贝叶斯算法[12]，设置置信度阈值为0.7，基于Silva数据库（Release123 http：//www.arb-silva.de）[13]，对OTU代表序列进行分类学分析，并在各个水平（界、门、纲、目、科、属、种）统计每个样品的群落组成。基于OTU聚类分析结果，在Origin中绘制群落结构组分图，同时利用R语言gplots包，绘制物种丰度的热图。通过R语言cor函数计算生物胺含量与所选物种的相关系数，然后采用corrplot包进行可视化。

2 结果与分析

2.1 黄酒小曲中细菌群落结构分析

黄酒小曲俗称酒药、酒饼，是我国特有的酿酒用糖化剂和发酵剂，同时具有糖化和发酵功能，包含细菌、酵母、霉菌等各种微生物，直接影响黄酒的质量。本研究使用高通量测序技术对小曲中细菌群落结构进行了分析，结果见图1。

图1 黄酒小曲中细菌群落结构（属水平）Fig.1 Bacteria community structure in Xiao Qu（genus）

从图1中可以看出，在属水平上，小曲中主要包含13个属的细菌，分别是芽孢杆菌属（Bacillus）、魏斯氏属（Weissella）、乳杆菌属（Lactobacillus）、泛菌属（Pantoea）、肠杆菌属（Enterobacter）、克雷伯菌属（Klebsiella）、沙雷氏菌属（Serratia）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、短波单胞菌属（Brevundimonas）、柠檬酸杆菌属（Citrobacter）、不动杆菌属（Acinetobacter）、片球菌属（Pediococcus）和变形纲门（Mitochondria norank）。其中优势菌是芽孢杆菌属（69.21%）、魏斯氏属（14.07%）、乳杆菌属（5.37%）、肠杆菌（2.43%）和克雷伯菌属（2.68%），而未检测到糖多孢菌属（Saccharopolyspora）细菌。芽孢杆菌属的细菌之所以能在小曲中占较高比例，原因可能是芽孢杆菌能够在不利的环境中以芽孢的方式生存，具有一定的耐强酸碱，耐高温的特点[2]。

2.2 麦曲中细菌群落结构分析

麦曲是黄酒中重要的糖化剂，含有细菌、酵母、霉菌等微生物[14]。麦曲在投料时这些微生物会一并带入发酵液，是黄酒发酵微生物的重要来源[15-16]。通过高通量测序分析得到麦曲中细菌群落结构结果，见图2。

由图2显示，在属水平上，麦曲中丰度大于0.1%的细菌来自蓝细菌（Cyanobacteria norank）、变形纲门（Mitochondria norank）、糖多孢菌属（Saccharopolyspora）、泛菌属（Pantoea）、芽孢杆菌属（Bacillus）、肠杆菌科（Enterobacteriaceae unclassified）、沙雷氏菌属（Serratia）以及链霉菌属（Streptomyces）。其中蓝细菌、变形纲门和糖多孢菌属细菌的丰度分别为33.19%，27.86%和24.22%。糖多孢菌属细菌是一类分布在土壤、河流和湖泊中安全的生物资源菌，同时发现，在麦曲中乳杆菌属细菌丰度仅为0.02%。这与刘芸雅等[3]的报道不一致，原因可能是麦曲原料的来源地不同引起的。

图2 黄酒麦曲中细菌群落结构（属水平）Fig.2 Bacteria community structure in Wheat Qu（at genus level）

2.3 黄酒生产过程中细菌群落结构分析

2.3.1 黄酒生产过程中不同阶段的OTU数变化

本研究采用Illumina Miseq测序平台对原米、浸米和发酵过程中细菌的16S rRNA的V3-V4区域进行分析，通过对数据优化处理，得到不同样品中的OTU数。结果表明，不同生产阶段发酵液中的OTU数在122～474不等，表明黄酒生产过程中各个阶段细菌物种丰富，并且物种多样性变化明显，具体结果如图3所示。

图3 黄酒生产过程中细菌OTU变化Fig.3 Changes in bacterial OTU during the production of rice wine

由图3可见，原料原米和浸米样品中OTU数为120左右，从前酵开始，OTU数升高，达200，呈上升趋势，说明前酵后细菌多样性增加，加入的酒药和麦曲开始起作用，微生物种类增加。压榨后，OTU数整体减小，物种多样性逐渐降低，这与刘芸雅等[3]的报道一致，也与白酒中细菌的变化情况一致[17-19]。原因可能是在发酵开始阶段，原米、酿造水、外部环境都会带入一部分细菌，加之发酵初期黄酒醪液中的营养成分丰富，有利于这些细菌中的部分细菌生长；随着发酵的继续进行，酒精度的升高、氧气含量的降低以及酸度增加，使得一部分无法适应此环境条件的微生物生长受到抑制[3]。

2.3.2 黄酒生产过程中细菌群落结构在门水平上的变化

进一步对原米、浸米和不同生产阶段发酵液中细菌群落结构进行分析，将测序样品的序列进行比对，在生物分类学门的水平进行分类，分析结果见图4。

图4 黄酒生产过程中细菌群落结构变化（门水平）Fig.4 Changes in bacterial community structure during the production of rice wine（at kingdom level）

由图4可以看出，原米与浸米及发酵液中主要由5个门构成：厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、蓝藻门（Cyanobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和放线菌门（Actinobacteria），这 5 大类细菌在整个发酵过程中均一直存在，且丰度变化比较显著。比较原米和浸米的细菌群落结构，浸米中大量引入了厚壁菌门细菌，随后蒸饭中该门细菌丰度有所降低。不过在后期的工艺流程中丰度逐渐增加，在清酒期间达到最高丰度，成为发酵液中的优势菌。

2.3.3 黄酒生产过程中细菌群落结构在属水平上的变化

进一步对不同发酵阶段中细菌群落结构进行分析，将丰度前30的细菌数据（属水平）进行丰度相似性聚类，然后将其表示在热图上（图5）。

图5 黄酒生产过程中细菌属水平上各工艺流程物种丰度变化热图Fig.5 Species abundance change heat map at genus level during the process of rice wine

通过颜色深浅梯度及相似程度来反映多个样本在各分类水平上群落组成的相似性和差异性。在整个工艺流程中蓝细菌的丰度呈下降趋势，直到清酒过程达到最低，但最后的煎酒结束，发现其丰度有所上升。同时，变形纲门细菌也具有表型相同的趋势。原米经过浸泡后，微生物群落发生显著变化，乳杆菌属和乳球菌属（Lactococcus）微生物成为群落中的优势种属，同时浸米水中醋酸杆菌属（Acetobacter）也达到了20%的丰度。狭义的梭菌属（Clostridium sensu stricto）在清酒的发酵液中丰度出现井喷式增加，由占上一阶段压榨结束后的不到1%增加到30%左右。假单胞菌属（Pseudomonas）微生物在原米中的丰度为3.4%，在发酵过程中丰度维持在1%左右，在最后的煎酒检测中，其成为群落中的优势种属之一，由前期的1%左右增加到7.6%。而蓝细菌、变形纲门以及芽孢杆菌属细菌丰度降低。

2.4 黄酒生产过程中生物胺含量与菌群变化

2.4.1 黄酒生产过程生物胺含量变化分析

通过测定麦曲和小曲及不同生产过程中生物胺的含量变化，结果如表1所示。

表1 黄酒生产过程中生物胺含量变化Table 1 Changes of biogenic amine during the production of rice wine

从表1可以看出，腐胺（Putrescine）是黄酒生物胺中的主要成分，其次是色胺（Tryptamine）、酪胺（Tyramine）、苯乙胺（Phenethylamine）、亚精胺（Spermidine）、尸胺（Cadaverine）、精胺（Spermine），而未检测到组胺（Histamine）。浸米体系中腐胺含量高达26.47 mg/kg，但随着浸米水的去除以及淋米环节，落缸后体系中的腐胺含量显著下降。从落缸到压榨，腐胺的含量逐渐上升，后酵结束压榨阶段其含量高达29.08 mg/L；压榨后其含量逐渐下降。

通过测定麦曲和小曲及不同生产阶段生物胺的含量变化可以看出，在麦曲中，生物胺含量比较高，总量为56.53 mg/L，小曲中生物胺总量为18.34 mg/L，与张凤杰等[20]报道一致。在生产阶段，从落缸到压榨，腐胺的含量逐渐上升，压榨后进行高温杀菌，微生物不再起作用了，所以腐胺含量逐渐下降。色胺、酪胺、亚精胺和精胺在前酵结束后含量最高，然后下降。

黄酒中的生物胺主要来自微生物代谢，酿酒工艺（如不同基质）通过影响这些微生物的生长和代谢而影响生物胺含量。另外，试验发现有些乳酸菌不产生物胺，甚至能分解部分生物胺。在不影响黄酒口味和营养的前提下，通过调整酿造工艺，使这部分优势菌株发挥其优良的酿造特性，并抑制其他菌株的代谢，可以控制和降低黄酒生物胺。黄酒的机械化和现代化酿造是行业发展的方向，利用安全性好且发酵性能优良的菌株或菌群可以从根本上控制生物胺。有研究已证明将植物乳杆菌应用于浸米过程，可降低浸米水中的生物胺[21－22]。

2.4.2 生物胺含量变化与菌群结构的相关性分析

在落缸后整个生产过程中，比较生物胺含量与细菌丰度的相关性如图6。由图6可知腐胺的积累与乳杆菌属、明串珠菌属（Leuconostoc）、鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium）、不动杆菌属和稳杆菌属（Empedobacter）细菌丰度的增加呈显著相关性（P＜0.05），也就是说以上5类细菌对腐胺的产生做出了重要贡献。腐胺和尸胺的变化具有一定的相关性，与腐胺呈正相关的细菌同时与尸胺的变化具有一致的相关性。酪胺的含量变化与乳杆菌属、魏斯氏属和片球菌属的丰度呈正相关，其中与片球菌属的相关系数为0.92。总体而言，生物胺的积累与乳杆菌属、明串珠菌属、魏斯氏属、鞘氨醇杆菌属、片球菌属、新鞘氨醇杆菌属（Novosphingobium）、梭菌属（Clostridium）以及肠菌科细菌丰度的增加具有一定的相关性。Hong等发现[23]，黄酒酸败是由于发酵前期乳杆菌属细菌，特别是短乳杆菌（L.brevis）大量繁殖导致的，此时发酵液中有益微生物多样性和丰度均显著降低。结合本研究发现浸米中乳杆菌属细菌显著增加，推测浸米中腐胺含量显著增加与乳杆菌属细菌迅速繁殖密切相关。Beatriz del Rio等[24]研究发现，乳酸乳球菌（L.lactis）在酸性条件下转录激活腐胺的生物合成。同时该实验室证实，可以通过NaCl抑制细胞的生长和基因的表达从而降低腐胺的产量[25]。结合研究显示，整个黄酒生产过程中生物胺的产生不仅来自细菌，某些真菌，如柠檬形克勒克氏酵母（Kloeckera apiculata）、美极梅奇酵母菌（Metschnikowia pulcherrima）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），同样具有生物胺转化能力[26]。

图6 黄酒酿造过程中生物胺含量与微生物群落结构相关性Fig.6 Correlation between biogenic amine content and change of microbial community structure during the process

3 结论

本研究采用Illumina Miseq测序平台对黄酒麦曲及其发酵过程中的细菌群落结构进行系统分析，同时对不同阶段生物胺含量采用高效液相色谱法进行精准测定。结果表明，黄酒小曲、麦曲及发酵过程中的发酵液中细菌具有丰富的物种多样性，且发酵过程中细菌多样性整体呈减少趋势。麦曲中最主要优势菌为芽孢杆菌属、糖多孢菌属，发酵过程中的微生物组成与麦曲有一定的相关性，投料后细菌群落结构变化较大。在属水平上，优势菌包括糖多胞菌属、芽孢杆菌属、葡萄球菌属、乳杆菌属、明串珠菌属、乳球菌属和肠杆菌属，且不同类群细菌的变化情况呈现多样性。其中，乳杆菌属、明串珠菌属、魏斯氏属、鞘氨醇杆菌属、片球菌属以及肠菌科细菌丰度的增加与生物胺的产生具有显著相关性。通过菌群结构与生物胺含量变化的相关性分析，为绍兴黄酒产品质量控制提供科学依据。

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