ST细胞冷冻密度对复苏的影响

2018-06-05任德强宋新刚张立恒

畜牧兽医科技信息 2018年5期

任德强，宋新刚，张立恒

（哈尔滨元亨生物药业有限公司，黑龙江哈尔滨 150026）

ST细胞是猪睾丸细胞，主要用于猪细小病毒、猪瘟等疫苗的制备。为了降低长期传代对细胞造成的损伤，需要对其进行低温冷冻保存。低温冷冻保存是细胞长期保存的唯一方法，还可减少细胞被微生物污染的风险，减少因传代培养而引起的细胞遗传变异和形态改变。因此要找到一个适合的冻存密度，使细胞在冻存和复苏过程中活力下降最少。该试验中以4个不同的密度冻存ST细胞，复苏后检验活力，并分析冻存密度与活力之间的关系。

1 材料和方法

1.1 试剂

培养液MEM(Gibco)；胎牛血清FBS(Gibco)；二甲基亚砜(Sigma)；Trypsin-EDTA(Gibco)。

1.2 细胞系

ST传代细胞购自中国兽医药品监察所。

1.3 主要仪器设备

CO2培养箱 (HF240型)，HealForce公司；细胞计数仪Countstar，上海睿钰公司；细胞培养瓶，美国Corning公司；倒置显微镜（TS100），Nikon公司。

1.4 冻存液的配制

MEM的含量为60%，DMSO 10%，血清 30%。

1.5 细胞的消化

消化对数生长期的细胞，1000r/min离心 5min。

1.6 不同密度细胞液的配制

离心后弃上清液，加入适量冻存液，计数，配制4个不同密度的细胞液：0.5×107个/mL；1.0×107个/mL；2.0×107个/mL；3.0×107个/mL。

1.7 细胞分装与冻存

将4个不同密度的细胞液进行计数，计算活力，然后分别装入冻存管中，l.5mL/管。4℃放置2h，-80℃放置18h，放入液氮中的程序进行冻存。

1.8 细胞复苏

细胞冻存2周后进行复苏，每个密度复苏3管。从液氮中取出冻存管直接放入37℃温水中，并不时摇动使其在1 min内尽快融化。融化后以1000r/min离心5min，弃上清液，每管加入1.5mL培养液，计数测活力。以上操作重复3次。

2 结果

2.1 细胞冻存前的密度和活力见表1。细胞活力都在90%以上，符合细胞冻存标准。

2.2 复苏后细胞的密度和活力。

3 讨论

猪睾丸细胞（ST）在贴壁条件下，可以实现在体外的连续培养，该细胞系对猪瘟、细小病毒、传染性胃肠炎等多种病毒敏感，是疫苗生产中的常用细胞，细胞系的保存条件对疫苗生产至关重要。

上海畜牧兽医研究所的彭丽英等人从中国兽医药品监察所引进40代ST细胞，在传代过程中对细胞的生长速度、外源病毒检测、染色体数目等项目进行检测，并建立了ST细胞种子库的冻存方法，为疫苗生产的开展奠定了工作基础。在本研究中对ST细胞的冻存和复苏进行研究发现，细胞复苏后的活力也都在90%以上，3次试验复苏后的平均活力分别与细胞冻存前的活力相比较，3次试验冻存前的活力虽然与细胞密度没关系，但无论细胞是以多大的密度冻存，复苏后，细胞的活力都会有所下降，而且会随着冻存密度的增高而降低。虽然降低的幅度不是很大，都在90%以上，但也说明冻存细胞的密度与复苏后细胞的活力呈反比。因此冻存细胞的密度与复苏后细胞的活力有相关性。