猪圆环病毒2型ZJ/C株增殖条件的优化

陈川林 ，杜爱芳

（1.浙江大学动物科学院，浙江 杭州 310058；2.杭州佑本动物疫苗有限公司，浙江 杭州 310018）

猪圆环病毒2型（PCV2）是引起猪圆环病毒病（PCVD）的主要病原。猪圆环病毒病是世界各国公认的危害养猪业的重要疫病，与“猪瘟”和“蓝耳病”统称为养猪业的“三座大山”，对猪群影响较大。防控猪圆环病毒病最有效的方法是疫苗免疫。目前国内已经生产的猪圆环病毒2型灭活疫苗有猪圆环病毒2型灭活疫苗SH株、猪圆环病毒2型灭活疫苗LG株和猪圆环病毒2型灭活疫苗DBN-SH07株，但是其效价都不是很高。通常PCV2在PK15细胞上的TCID50一般在104～105。

本实验利用猪圆环病毒2型优势株（PCV2-ZJ/C株，其毒价可达到106.0TCID50/0.1mL），在PK15-ZJU细胞上增殖条件的优化，以摸索适合猪圆环病毒2型灭活疫苗（ZJ/C株）生产的工艺条件。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞与毒株

PK15-ZJU细胞与PCV2-ZJ/C株，均来自农业部动物病毒学重点开放实验室。

1.1.2 主要试剂

DMEM干粉，Gibco公司产品；胰蛋白酶，Sigma公司产品；新生牛血清，Hyclone公司产品；D-氨基葡萄糖，Sigma公司产品；其它试剂均为分析纯。

1.1.3 主要仪器设备

PH计，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司产品；水浴锅 DK-80，上海精宏实验设备有限公司产品；CO2培养箱，日本SANYO公司产品；荧光显微镜，日本尼康公司产品；电子天秤，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司产品。

1.2 方 法

1.2.1 细胞制备

从液氮罐取出PK15-ZJU细胞置37℃水浴快速融化，加入含8%新生牛血清的DMEM细胞生长液，置37℃、含5%CO2的培养箱培养。待其生长成单层细胞，加入0.02%EDTA-0.05%胰蛋白酶消化液，在37℃下作用5～8min，加入细胞生长液制成细胞悬液，分装于细胞培养瓶中，37℃、12转/h培养，一般48h即可形成细胞单层。

1.2.2 毒种复壮

取毒种（PCV2-ZJ/C株）按细胞培养液1%的量接种到新消化的PK15-ZJU细胞悬液，37℃、5%CO2培养箱培养72h，-20℃冻融3次，收获细胞培养物，测TCID50。

1.2.3 最佳细胞接种密度确定

将消化、分散后的 PK15-ZJU细胞密度分别调整为1.5×105、2.0×105、2.5×105、3.0×105和 3.5×105个 /mL 5个浓度，每个浓度3个转瓶，同步接种1%的PCV2-ZJ/C病毒液（毒种滴度为106.4TCID50/0.1mL），37℃、12转/h培养48h，换含3%血清的维持液，继续培养36h收获病毒液，-20℃冻融3次，测TCID50，以确定适合病毒增殖的最佳细胞接种密度。

1.2.4 不同接毒方法与病毒增殖的关

按表1中4种方法接毒，收获病毒液后于-20℃冻融3次，测TCID50，以确定适合病毒增殖的最佳接毒方法（接毒比例为1%，D-氨基葡萄糖为300mmol/L）。

表1 不同接毒方法

1.2.5 收获时间与接毒量的确定

将长成单层的 PK15-ZJU细胞用消化液消化后，制成2.5×105个/mL的细胞悬液，分别同步接种1%、2%和3%的PCV2-ZJ/C(种毒效价为 106.4TCID50/0.1mL)各 5 瓶，37℃、12转/h培养24h，弃去营养液，加PBS清洗一遍后加300mmol/L的D-氨基葡萄糖作用30min，弃去D-氨基葡萄糖加含3%血清的维持液继续培养。培养72h后每6h取一瓶，-20℃冻融3次，测病毒滴度。

1.2.6 冻融次数确定

按之前试验得出的结果进行病毒的培养，收获病毒液后，分别在-20℃条件下冻融1、2、3、4次，然后分别测定病毒TCID50，以其中TCID50最高者为病毒的最佳冻融次数。

1.2.7 收获毒液的病毒含量（TCID50）测定

取病毒液用无血清的DMEM培养液做10倍系列稀释，从10-4～10-9，共6个稀释度，分别将稀释好的病毒液等体积加入到每孔含有100μL PK15-ZJU细胞悬液的96孔细胞培养板中。每个稀释度接种6孔，同时设PCV2-ZJ/C株阳性细胞对照4孔和空白细胞对照4孔。接种后放置37℃，含5%CO2培养箱培养72h。弃去培养液，将培养的细胞用冷甲醇-丙酮液固定后，与鼠源抗PCV2衣壳蛋白单克隆抗体反应，然后与FITC标记的羊抗鼠IgG反应，最后用倒置荧光显微镜观察每个稀释度的PCV2阳性细胞（荧光显微镜下产生绿色荧光）。根据每个稀释度的阳性细胞孔数，按Reed-Muench方法计算病毒的TCID50。

2 结果

2.1 最佳细胞接种密度确定

从图1可以看出细胞接种密度为2.5×105个/mL时，病毒滴度最高。细胞接种密度为3.5×105时，病毒滴度最低。因此，取最佳细胞接种密度为2.5×105个/mL。

图1 细胞接种密度对病毒增殖的影响

2.2 接毒方法的确定

从图2可以看出采用同步接毒加D-氨基葡萄糖处理的方法接毒，病毒滴度最高，达到106.36TCID50/0.1mL；其次为同步接毒不加D-氨基葡萄糖处理；分步接毒不加D-氨基葡萄糖处理的病毒滴度最低。因此，确定最佳的接毒方法为同步接毒加D-氨基葡萄糖处理。

图2 不同接毒方法对病毒增殖的关系

2.3 最佳接毒量与收获时间的确定

从表2可以看出接毒量为2%，病毒感染90h后收毒获得到了病毒的最高滴度106.84TCID50/0.1mL。接毒量为1%和2%时，病毒的滴度都是先随时间的延长而升高，在90h达到了最高值，而后随时间的延长而降低。接毒量为3%时，病毒的滴度也是先随时间的延长而升高，但是最高值出现在84h，而后随时间的延长而降低。所以PCV2-ZJ/C增殖的最佳接毒量为2%，最佳收获时间为90h。

表2 不同接毒量及收获时间时的病毒滴度

2.4 最佳冻融次数的确定

图3 冻融次数与病毒滴度的关系

从图3可以看出冻融2次时，病毒的滴度最高，为106.60TCID50/0.1mL。因此取冻融2次为最佳冻融次数。

3 讨论

在体外培养动物细胞中增殖病毒，细胞接种密度对病毒的增殖有影响。主要是通过细胞的生长状态来影响病毒的增殖。细胞接种密度过低，导致营养液pH升高变碱，抑制细胞的生长，甚至引起细胞死亡。细胞接种密度过高，导致单个细胞营养成分不足，及细胞间相互竞争营养成分，也会抑制细胞的生长。所以合适的细胞接种密度才可以促进细胞的生长，从而促进病毒的增殖。

从本实验看采用同步接毒的方法病毒滴度高于分步接毒，可能是因为PCV2的繁殖要利用PK15细胞复制S期的蛋白。此外研究表明，D-氨基葡萄糖一方面可以增强PK15细胞S期蛋白的表达，另一方面可以促进病毒的DNA进入细胞核，从而增强病毒的增殖，Tischer等最先用D-氨基葡萄糖来提高PCV2的增殖，此后D-氨基葡萄糖普遍用于PCV2的接毒感染实验。Gilpin等用300 mM的D-氨基葡萄糖刺激能够显著增加病毒的增殖能力。本试验通过添加D-氨基葡萄糖处理接毒的PK15细胞，使得PCV2的滴度升高了。

接毒量和收获时间也会影响病毒的滴度，合适的接毒量才可以获得高滴度的病毒。接毒量低，病毒滴度达到高峰的时间延长，细胞状态下降，不利于病毒的增殖；接毒量高，病毒间的自我干扰作用，也不利于病毒的增殖。掌握好收毒的时间也是获得高滴度病毒的关键，因为收毒太早，病毒不能充分增殖，而收毒太晚，部分从细胞中释放出来的病毒在37℃环境中死亡。冻融次数也会影响病毒的滴度，这是因为冻融次数过多，会损伤病毒，降低病毒的活力。冻融次数少，不能使病毒完全从细胞中释放。

PCV2-ZJ/C株从本实验来看其滴度可以达到106.84TCID50/0.1 mL，符合国家规程要求每mL病毒含量应大于等于106.30TCID50的标准。而且，抗原滴度的提高，极大地提高了同剂量疫苗中抗原的含量，对免疫效果的增强具有重要的意义。

在转瓶上通过对PCV2-ZJ/C株在PK15-ZJU细胞上增殖条件的优化，试验结果表明，采用同步接毒加D-氨基葡萄糖处理的方法接毒，细胞接种密度为2.5×105个/mL，接毒量为2%，接毒后90h收获，-20℃冻融2次的条件下，PCV2-ZJ/C株增殖效果最好。这为猪圆环病毒2型灭活疫苗（ZJ/C株）的规模化生产提供了参考依据。

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