转GO基因水稻杂交后代对稻瘟病及纹枯病的田间抗性评价

谢 戎， 刘成元， 李永洪， 何 珊，向箭宇

(1.四川省农业科学院水稻高粱研究所/农业部西南水稻生物学与遗传育种重点实验室,四川 德阳 618000；2.农业部西南作物有害生物综合治理重点实验室，四川 成都 610066)

【研究意义】稻瘟病(Rice blast)和纹枯病(Rice sheath bight)是水稻生产上2种重要的真菌病害。稻瘟病在田间从水稻秧苗期开始以为害叶片为主，严重时造成化苗；灌浆后为害穗颈、枝梗及颖壳等，严重时造成穗颈折断而大幅减产。纹枯病在田间从水稻分蘖盛期开始以为害叶鞘为主，逐步向上为害上部叶鞘及叶片，严重时造成上部叶片枯死及后期倒伏，也严重影响产量。【前人研究进展】稻瘟菌[Magnaporthegrisea(Hebert)Barr.]及纹枯菌(RhizoctoniasolaniKühn)侵染水稻的机制各不相同，前者为专化性侵染，后者为非专化性侵染[1-4]。由于稻瘟菌与水稻品种的专化性互作，造成抗病品种在生产上使用3～5年后丧失其抗病性[5-6]。而纹枯菌寄主范围宽、腐生性强，使得目前水稻中尚未发现对该病免疫或高抗的水稻种质[7-8]。大量研究表明，一些外源基因能诱导寄主在受到病菌侵染时产生系统获得性抗性(Systemic acquired resistance SAR)[9 -12]，这为培育抗稻瘟病、纹枯病的新品种提供了新的技术手段。前文对转GO基因杂交后代株系对稻瘟病生理小种的抗谱进行了初步研究，发现有的后代株系抗病频率达80 %以上，明显高于其亲本[13]，但在田间的抗感反应需进一步观察。【本研究切入点】本文对转GO基因杂交后代对稻瘟病和纹枯病的田间抗性进行了初步研究。【拟解决的关键问题】以便为新品种培育提供新的抗源，为抗病机制研究提供新材料。

表1 46个GO基因杂交后代组合来源及编号Table 1 Name and code of 46 transgenic rice filial generation with glucose oxidase gene

1 材料与方法

1.1 供试材料

46个GO基因杂交后代来源及编号见表1，2013年世代为F5，2015年为F7，2016年为F8。配制杂交组合的5个恢复系：明恢63、乐恢188、缙恢21、R473、H103来源于本课题亲本圃。以LJH为稻瘟病对照，Lemont为纹枯病对照。

1.2 试验方法

1.2.1 病圃自然诱发鉴定 试验分别于2013、2015及2016年在本所叙永水尾稻瘟病圃进行。每年3月20日播种，地膜湿润秧。将恢复系明恢63及普感品种LJH混合作为诱发品种，待诱发品种秧苗3叶1心时接种上年收集的病稻草。每个供试材料栽1行10窝，3～4苗/窝，栽培规格16.5cm × 19.8cm，两厢供试材料之间栽2行诱发品种。待诱发品种充分发病时调查叶瘟，抽穗后20 d调查穗颈瘟，同时调查纹枯病发病情况。

1.2.2 调查标准 ⑴病叶率( %)= 病叶数 / 调查总叶数 × 100。叶瘟分级标准：每个材料调查30片叶，按下列标准记载每叶发病级别，计算病情指数 %=∑(各级病叶数 × 各级代表值)/ (调查总叶数 × 最高级代表值) × 100(下同)。

0级：无病斑；1级： 针头大小的褐点或无产孢中心的较大褐点；2级： 圆形至椭圆灰色坏死小斑，直径1～2 mm，边缘褐色，绝大多数病斑分布在下部叶片；3级： 病斑型同2级，绝大多数病斑分布在上部叶片；4级： 典型病斑，病斑长度3 mm以上，常局限于2条叶脉之间，侵染叶面积小于2 %；5级： 典型病斑，侵染叶面积2 %～10 %；6级： 典型病斑，侵染叶面积11 %～25 %；7级： 典型病斑，侵染叶面积26 %～50 %；8级： 典型病斑，侵染叶面积51 %～75 %，部分叶片枯死；9级： 典型病斑，侵染叶面积大于75 %，绝大多数叶片枯死。

⑵病穗率( %)= 病穗数 / 调查总穗数×100。颈瘟分级标准：每个材料调查30穗，按下列标准记载每穗颈瘟级别，计算病情指数。

0级(免疫)： 全穗无病；1级(高抗)： 枝梗瘟，小于5 %谷粒受枝梗瘟影响；3级(抗)： 枝梗瘟，5 %～10 %左右谷粒受枝梗瘟影响；5级(中抗)： 枝梗瘟，10 %～25 %谷粒受害；7级(感)： 多个枝梗或主枝梗发病，25 %～50 %谷粒受害；9级(高感)： 主枝梗或穗颈发病，超过50 %谷粒受害。

⑶病秆率( %)= 发病茎数 / 调查总茎数×100。纹枯病分级标准：每个材料调查30茎，按表2记载每茎发病级别，计算病情指数。

1.2.3 抗感级划分 以3年中每个株系(材料)最高病级划分该株系的抗(感)级(表2)。

2 结果与分析

2.1 46个转GO基因杂交后代田间抗感株系分布

从图1可以看出，田间中抗-高抗稻瘟病的株系占46个供试株系的23.9 %，高感株系比例大，占50.0 %；中抗-抗纹枯病的株系占15.2 %，中感株系比例大，占52.2 %。说明多数供试的转GO基因杂交后代不抗稻瘟病和纹枯病，田间表现抗2种病害的株系出现频率较低，但中抗及其以上病级的抗稻瘟病的株系比抗纹枯病的株系多8.7 %。

表2 纹枯病抗性分级Table 2 Classification of resistance to rice sheath blight

2.2 各株系对稻瘟病及纹枯病的田间抗性表现

2.2.1 年度间相同株系的抗性差异 从表3可以看出，不抗的株系年度间田间抗感反应变化较大，如株系J572，3年病穗率分别为56.1 %、5.0 %及40.0 %，病秆率分别为90.0 %、15.1 %及100 %；又如株系HR320，3年病穗率分别为4.3 %、11.2 %及85.0 %，病秆率88.9 %、20.0 %及80.0 %，2015年的发病程度明显偏轻。但抗性较好株系年度间抗感反应变化较小，如对稻瘟病高抗株系HR332，3年病穗率分别为5.0 %、2.3 %及4.8 %；对纹枯病抗的株系HR337，3年病秆率分别为9.0 %、45.3 %及20.0 %。上述结果表明，田间抗性鉴定主要受年度间发病程度差异影响较大，仅1年的鉴定结果可靠性较差。

2.2.2 株系间的抗性差异 从表3可以看出， 对稻瘟病达到高抗的株系2个(HR321及HR332)，抗的株系3个(J668、J670及HR324)，中抗株系6个(J618、J669、J779、J792、HR333及HR336)，感病株系12个，高感株系23个；对纹枯病达到抗的株系2个(HR337及HR339)，中抗株系5个(HR332、HR333、HR334、HR336及HR338)，中感株系24个，感病株系9个，高感株系6个。

图1 46个转GO基因杂交后代田间病级分布Fig.1 Distribution of rice blast and sheath blight disease grade of 46 transgenic rice filial generation with glucose oxidase gene in the field

HR332既高抗稻瘟病，又中抗纹枯病；HR333及HR336对稻瘟病和纹枯病均表现为中抗；HR321高抗稻瘟病，中感纹枯病；J668、J670及HR324抗稻瘟病，感纹枯病；J618、J669、J779及J792中抗稻瘟病，也对纹枯病表现为感病。HR337及HR339抗纹枯病，但感或高感稻瘟病；HR334及HR338均中抗纹枯病，但高感稻瘟病。由此看出，①在46个转GO基因杂交后代株系中，同时抗稻瘟病和纹枯病的株系很少，只抗1种病害的株系相对较多。②株系间由于其遗传背景不同，对病菌侵染后的抗性反应差异很大。

2.2.3 不同杂交组合间抗性株系比较 对不同杂交组合后代达中抗以上的株系进行归类(表4)，日本晴(转G)/蜀恢162、日本晴(转G)/蜀恢162//乐恢188及日本晴(转G)/蜀恢162//R473这3个组合后代出现了既抗稻瘟病又抗纹枯病的株系；日本晴(转G)/蜀恢162//缙恢21后代出现只抗稻瘟病或抗纹枯病的株系；日本晴(转G)/蜀恢162//明恢63及日本晴(转G)/蜀恢162//H103这2个组合后代未出现抗纹枯病的株系。日本晴(转G)/蜀恢162阳性单株(F2)后代[14]，经多代选择稳定的3个株系中，仅HR333既中抗稻瘟病又中抗纹枯病。

供试的5个亲本中，明恢63、缙恢21、H103高感稻瘟病，乐恢188及R473感稻瘟病，其相应杂交组合后代中出现了中抗至高抗的株系，稻瘟病抗性较亲本有显著提高。乐恢188本身中抗纹枯病，其余4个亲本中感纹枯病，日本晴(转G)/蜀恢162//乐恢188、日本晴(转G)/蜀恢162//明恢63及日本晴(转G)/蜀恢162//H103这3个组合的后代纹枯病抗性未有所提高；日本晴(转G)/蜀恢162//缙恢21及日本晴(转G)/蜀恢162//R473其后代出现纹枯病抗性水平明显提高的株系。显然，GO基因的表达受遗传背景的影响，在不同遗传背景中，调控水稻发生抗病反应的程度也有较大差异。

表3 GO基因杂交后代对稻瘟病及纹枯病的田间抗性表现Table 3 Field resistance of transgenic rice filial generation with glucose oxidase gene to blast and sheath blight

续表3 Continued table 3

材料编号Material code年份Year叶瘟 Leaf blast穗颈瘟 Panicle neck blast纹枯病 Sheath blight病叶率 ( %)Rate of diseased leaf 病情指数Diseaseindex病穗率 ( %)Rate of diseasedpanicles 病情指数Diseaseindex抗性评定Resistance assessment病秆率 ( %)Rate of diseased stalk 病情指数Diseaseindex抗性评定Resistance assessmentJ659201358.858.840.029.3感S10091.1高感HS201525.02.837.125.543.912.72016--7.95.385.544.6J668201357.157.13.05.0抗R55.642.9中感MS201516.13.84.52.735.78.32016--6.35.970.037.8J669201339.039.03.02.0中抗MR20.017.1中感MS201520.05.011.58.330.76.72016--25.017.595.058.1J670201360.345.82.03.5抗R77.845.6中感MS201540.011.710.01.150.110.02016--8.34.460.520.7J688201378.752.810082.4高感HS50.038.9中感MS201515.02.865.115.020.63.32016--25.010.410045.0J715201358.936.32.02.0高感HS33.333.3中感MS201531.15.645.221.730.57.82016--93.548.610055.8J735201354.833.787.583.3高感HS62.562.5感S201520.63.380.030.035.25.02016--7.53.975.050.9J737201343.734.872.742.4高感HS100100高感HS201530.06.75.00.635.08.32016--10.25.960.327.9J779201331.725.015.010.7中抗MR10046.7中感MS20152.34.425.06.155.59.42016--10.56.795.050.9J792201351.335.814.312.2中抗MR100100高感HS201540.98.913.78.545.335.22016--14.113.210061.2J793201346.833.230.024.3感S10076.0感S201550.09.220.02.275.019.42016--10.213.560.131.6J794201352.6.33.64.55.1高感HS10064.4感S201542.111.125.917.450.515.62016--10064.810062.1J848201352.133.92.02.0高感HS40.040.0感S201544.511.332.316.123.716.12016--10074.710071.1HR320201341.932.04.32.4高感HS88.969.1感S

续表3 Continued table 3

材料编号Material code年份Year叶瘟 Leaf blast穗颈瘟 Panicle neck blast纹枯病 Sheath blight病叶率 ( %)Rate of diseased leaf 病情指数Diseaseindex病穗率 ( %)Rate of diseasedpanicles 病情指数Diseaseindex抗性评定Resistance assessment病秆率 ( %)Rate of diseased stalk 病情指数Diseaseindex抗性评定Resistance assessment201515.03.911.27.420.02.22016--85.044.680.042.3HR321201344.234.02.02.0高抗HR81.342.2中感MS20155.00.64.72.815.13.92016--2.81.581.850.4HR323201323.515.942.934.9感S90.567.8感S201550.013.930.08.945.512.82016--34.723.180.140.5HR324201318.414.12.16.2抗R10064.4感S201515.03.33.62.333.219.72016--5.94.270.045.0HR325201343.525.610043.1高感HS72.365.6感S201541.210.615.03.940.15.62016--15.012.210057.6HR326201324.519.823.516.8高感HS40.018.9中感MS201545.610.610056.731.111.12016--22.316.785.048.3HR327201343.533.0.3.72.1高感HS16.67.2中感MS201562.522.210052.290.041.52016--45.034.775.427.5HR3282013----高感HS--中感MS201550.015.610056.522.32.32016--30.022.585.157.2HR329201340.026.011.07.8感S12.48.4中感MS201580.935.010.13.35.00.62016--31.518.075.344.6HR33020135.813.618.018.0感S9.03.0中感MS201585.127.250.013.335.511.72016--30.09.065.845.1HR331201349.438.97.53.4感S11.010.8中感MS201571.626.150.012.265.017.22016--15.04.165.055.2HR332201349.533.05.06.2高抗HR15.16.7中抗MR201535.111.12.35.410.13.32016--4.83.271.534.2HR333201318.614.412.511.1中抗MR13.04.2中抗MR201537.59.425.02.840.06.72016--25.015.850.026.1HR334201344.630.876.541.0高感HS30.122.0中抗MR201560.218.375.218.345.315.0

续表3 Continued table 3

材料编号Material code年份Year叶瘟 Leaf blast穗颈瘟 Panicle neck blast纹枯病 Sheath blight病叶率 ( %)Rate of diseased leaf 病情指数Diseaseindex病穗率 ( %)Rate of diseasedpanicles 病情指数Diseaseindex抗性评定Resistance assessment病秆率 ( %)Rate of diseased stalk 病情指数Diseaseindex抗性评定Resistance assessment2016------HR335201350.028.910.66.7感S10074.3感S201585.031.150.012.275.442.82016--15.17.710.81.8HR336201352.132.48.45.5中抗MR40.732.0中抗MR201560.520.623.711.337.328.22016------HR337201357.140.395.082.0高感HS9.08.4抗R201585.328.910096.745.317.22016--10081.020.07.2HR338201342.128.39.310.3高感HS9.610.0中抗MR201535.010.665.147.225.05.02016--10079.245.623.9HR339201350.536.05.02.3感S48.65.0抗R201510035.630.011.07.24.82016--50.032.410.16.3HR340201377.358.818.511.9感S10093.3高感HS201555.015.622.830.520.02.22016--33.221.69.95.4LJH (CK1)201384.462.596.983.0高感HS88.922.3感S201585.153.671.367.567.849.52016--93.279.090.165.8Lemont (CK2)201350.220.747.523.8感S89.969.2高感HS201540.326.932.919.677.152.02016--29.420.010081.0明恢63Minghui63201344.237.858.325.3高感HS30.422.5中感MS201550.133.239.925.020.112.82016--40.831.455.943.0乐恢188Lehui188201327.917.243.130.0感S42.015.9中抗MR201532.424.031.112.922.825.42016--33.723.533.624.6缙恢21Jinhui21201342.525.255.229.4高感HS44.928.5中感MS201532.618.441.430.234.020.32016--45.122.755.544.7R473201326.811.641.228.3感S39.242.7中感MS201530.521.621.513.222.515.32016--29.421.049.723.9H103201349.230.250.227.1高感HS33.948.1中感MS201544.123.530.522.513.720.62016--21.518.248.133.6

Note: HR—High resistant；R—Resistant；MR—Middle resistant；MS—Middle Susceptible；S—Susceptible；HS—High susceptible. ‘-’mean lack of observation data.

Note: HR: High resistant；R: Resistant；MR: Middle resistant. ‘-’ mean lack of observation data.

3 讨 论

前文[13]中，转GO基因后代株系HR320和HR332对稻瘟病生理小种的抗病频率>80 %，但HR320在2013年及2015年病圃中表现抗稻瘟病，但2016年病穗率达85 %，表现感病，而HR332在3年鉴定中均表现高抗，由此看出，仅凭1年抗谱测定结果或一年田间试验结果对一个材料的抗性尚不能做出准确的判断。经抗谱测定结并合田间鉴定表明，HR332是一个新的高抗稻瘟病抗源材料。经过3年观察，遗传背景不同的3个株系HR332、HR333及HR336对稻瘟病和纹枯病均有一定抗性(表3)。目前水稻中纹枯病的抗源很少[7-8]，本文中，HR337在3次田间鉴定中的纹枯病病指分别为8.4 %、17.2 %、及7.2 %，HR339分别为5.0 %、4.8 %及6.3 %，达到抗纹枯病的水平，可作为纹枯病抗源在育种中利用。

葡萄糖氧化酶存在于一些细菌和真菌中，专一催化β-D-葡萄糖氧化生成过氧化氢和葡萄糖酸。H2O2一方面能直接抑制和杀死病原菌，另一方面作为二级信使能激活和调控植物受病原菌侵染后引发的一系列防御反应，如诱发植物膜脂过氧化形成抗性病斑，增强细胞壁结构，诱导植保素合成等。由于不同寄主基因型与病原菌组合不同，产生防御反应所启动的信号传导途径就不同，导致不同遗传背景寄主防御反应的作用和表现特点也不同[14-19]。本文中，转GO基因杂交后代出现既抗稻瘟病又抗纹枯病的株系，仅抗稻瘟病不抗纹枯病的株系，或仅抗纹枯病不抗稻瘟病的株系等多种类型的抗性表现(表3)，这为研究其抗病机制提供了新材料。

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