与Wnt/β-连环蛋白信号通路相关的长链非编码RNAs的研究进展

罗晶 袁杰 综述

(哈尔滨医科大学附属第二医院心血管内科，黑龙江 哈尔滨 150001)

Wnt信号通路是脊椎动物中高度保守的信号通路之一，具有广泛的生物学作用，主要由细胞外Wnt信号蛋白、细胞膜上跨膜受体以及细胞内复杂的级联蛋白构成。根据Wnt蛋白转导信号方式不同，可分为经典Wnt信号通路和非经典Wnt信号通路。目前研究最为深入的是经典Wnt信号通路，也称为Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路。Wnt/β-catenin信号通路具有重要的生理作用，是目前公认的调控胚胎心脏发育的主要信号通路之一，在胚胎心脏发育过程中十分关键。在胚胎发育早期，Wnt/β-catenin信号通路激活，促进生心中胚层发育为心脏原基，而在胚胎发育晚期，该通路下调以维持正常心脏的形态与结构。其调控异常可使分化成心脏的中胚层形成障碍、心肌细胞分化受限、心脏体积变小，干扰胚胎心脏发育。此外，Wnt/β-catenin信号通路还参与缺血性心肌病和心脏重构等心血管系统疾病以及多种肿瘤的增殖和转移。

随着“DNA元素百科全书”(ENCODE)计划的完成，被认为是基因转录“噪音”的长链非编码RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)成为研究热点。LncRNAs是一类长度超过200个核苷酸，大部分具有5’端帽子结构和3’端多聚腺苷酸尾，由RNA聚合酶Ⅱ转录而生成几乎不含开放阅读框的非编码RNA。它能从表观遗传、转录及转录后等多个水平调控基因的表达，参与染色质修饰、基因组印记、X染色体沉默等多种重要过程。已有研究表明多种lncRNAs 与心脏发育、心血管系统疾病及肿瘤密切相关。同时，越来越多研究证实lncRNAs能与Wnt/β-catenin信号通路形成调节网络参与调控肿瘤的侵袭、迁移及心血管系统疾病的发生等。现就与Wnt/β-catenin信号通路相关的lncRNAs的研究进展及这些lncRNAs在心血管系统疾病中的作用进行综述(表1)。

1 HOX转录反义基因间RNA

1.1 HOX转录反义基因间RNA与Wnt/β-catenin信号通路的研究进展

HOX转录反义基因间RNA(HOX transcription antisense intergenic RNA，HOTAIR)是Rinn等[1]在人成纤维细胞中发现，长约2.2 kb，位于12q13.13上的HOXC基因座，能够与多梳蛋白抑制复合体2(polycomb repressive complex 2，PRC2)结合从表观遗传水平调控HOXD基因的表达。随后该研究团队发现HOTAIR能作为脚手架，5’端一个89 bp的片段能与PRC2结合[2]，3’端一个646 bp片段与赖氨酸特异性去甲基化酶(lysine specific demethylase 1，LSD1)/REI-沉默转录因子(REI-silencing transcription，REST)/共阻抑蛋白(Co-repressor of REST，CoREST)分别结合形成复合体，并引导复合体靶向与目的基因结合。PRC2 与LSD1/REST/CoREST复合物分别能使第3位组蛋白第27位赖氨酸三甲基化(H3K27me3)和第3位组蛋白第4位赖氨酸二甲基化(H3K4me2)，通过甲基化修饰来调控目的基因的表达。

表1 lncRNAs的研究进展

注：HOTAIR：HOX转录反义基因间RNA；MALAT1：肺腺癌转移相关转录本；UCA1：尿路上皮癌相关1；EZH2：果蝇zeste基因增强子人类同源物2

在多种肿瘤及心血管系统疾病中均证实HOTAIR与Wnt/β-catenin密切相关。在食管鳞状细胞癌中，HOTAIR表达升高，募集大量PRC2到Wnt抑制因子1(Wnt inhibitory factor-1，WIF-1)启动子区，促进H3K27me3导致WIF-1表达下降，激活下游Wnt/β-catenin从而促进肿瘤的迁移及浸润[3]。此外高表达的HOTAIR能激活Wnt/β-catenin以增强卵巢癌细胞对化疗的抵抗[4]。随后，Carrion等[5]发现HOTAIR能与Wnt/β-catenin构成调节网络参与调控心血管系统疾病。主动脉瓣钙化是常见的成人心脏病之一，而先天性二叶型主动脉瓣是其危险因素之一，先天性二叶型主动脉瓣患者瓣膜所受周期性张力增加。逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-PCR,RT-PCR)结果显示二叶型主动脉瓣患者瓣膜间质细胞中HOTAIR含量下降，主动脉瓣间质细胞钙化相关基因——肝/骨/肾型碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,liver/bone/kidney，ALPL)及重组人骨形态发生蛋白-2(recombinant human bone morphogenetic protein-2，BMP2)表达。用Wnt激动剂处理主动脉瓣间质细胞后，ALPL及BMP2含量升高，而HOTAIR水平下降。以上研究结果表明二叶型主动脉瓣所受周期性张力增加，激动Wnt/β-catenin以降低HOTAIR水平，从而促进ALPL、BMP2表达增加，最终导致主动脉瓣钙化。Greco等[6]报道在缺血性心力衰竭患者及小鼠肥大心肌组织中HOTAIR含量均降低，并且降低程度与压力负荷有关。同时基因富集分析显示HOTAIR与Wnt/β-catenin和心肌肥大通路密切相关，这预示HOTAIR可能参与心肌细胞肥大所致左心室重构，从而影响心力衰竭进程。以上研究均证实HOTAIR能与Wnt/β-catenin信号通路形成调节网络，调控肿瘤及心血管系统疾病。此外，HOTAIR与Wnt/β-catenin信号通路存在互相调控的现象，提示它们之间可能存在一个反馈环路，以维持生理状态下体内HOTAIR与β-catenin含量的相对稳定。

1.2 HOTAIR与心血管系统疾病的关系

Yang等应用RT-PCR分别检测对照组及冠心病组患者血浆HOTAIR水平，结果显示冠心病组患者血浆中HOTAIR水平升高。该研究首次提示HOTAIR可能作为诊断冠心病的潜在生物学标志物，然而冠心病患者血浆中HOTAIR升高机制仍需探索[7]。 Wu等[8]发现在脂多糖诱导的脓毒症小鼠模型中，HOTAIR含量升高，促进p65磷酸化，激活核因子κB相关通路，刺激心肌细胞产生肿瘤坏死因子-α。同时，HOTAIR的表达水平也与小鼠心功能有关，当抑制HOTAIR表达时，小鼠心功能显著改善。

2 肺腺癌转移相关转录本

2.1 肺腺癌转移相关转录本与Wnt/β-catenin信号通路的研究进展

Ji等在研究非小细胞肺癌时通过消减杂交法发现了与肿瘤转移及患者预后有关的肺腺癌转移相关转录本(metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)。核糖核酸酶P能剪切原始MALAT1，产生由61个核苷酸构成、类似转运RNA的MALAT1-相关小细胞质RNA(MALAT1-associated small cytoplasmic RNA，mascRNA)及成熟lncRNAs的MALAT1。MALAT1位于11q13，长约8.7 kb，5’端无帽子结构，3’端不含多聚腺苷酸并形成三螺旋结构以维持其稳定性。Hutchinson等发现MALAT1可招募丝氨酸/精氨酸富集蛋白，促进其磷酸化从而介导mRNA的前体加工[9]。该研究明确了MALAT1具有广泛的生物学功能。

多种肿瘤细胞中都有MALAT1的表达，但其具体作用机制尚不十分明确。在骨肉瘤、结直肠癌以及舌鳞状细胞癌等中均发现了MALAT1和Wnt/β-catenin信号通路的身影。Zhang等[10]应用RT-PCR检测骨肉瘤患者肿瘤组织，发现MALAT1表达水平高于瘤旁正常组织，且与淋巴结浸润及远处转移相关。沉默MALAT1可抑制骨肉瘤U-2OS细胞增殖、侵袭，下调β-catenin、基质金属蛋白酶7和原癌基因c-MYC等表达。此外，Ji等[11]研究表明白藜芦醇具有降低MALAT1表达，抑制Wnt/β-catenin信号通路从而抑制结直肠癌的侵袭及转移的作用。Liang等[12]发现在舌鳞状细胞癌组织中MALAT1升高，通过活化Wnt/β-catenin促进上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)及细胞增殖，抑制细胞凋亡。这些研究均证实MALAT1可激活Wnt/β-catenin信号通路促进肿瘤细胞的增殖、侵袭等病理过程。然而，也有报道指出在子宫内膜癌中，原钙黏蛋白10(protocadherin 10，PCDH10)启动子区CpG岛高甲基化后其表达下调，从而导致Wnt/β-catenin信号通路激活，使β-catenin及T细胞因子4结合到MALAT1启动子区，促进MALAT1表达[13]。有趣的是有文献报道HOTAIR能招募PRC2到PCDH10上，抑制其表达[14]。这提示lncRNAs之间可能存在调节网络，通过调控目的基因的表达从而调控其他lncRNAs的水平(图1)。

2.2 MALAT1与心血管系统疾病的关系

MALAT1与心肌细胞及血管内皮细胞增殖密切相关。Zhao等[15]发现在心肌细胞中高表达的重组人有丝分裂原激活蛋白激酶1可通过磷脂酰肌醇3-激酶/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶信号通路上调MALAT1以促进心肌细胞增殖。同时，在内皮细胞中也发现了MALAT1的身影，并广泛用于血管生长调控的研究。当体外内皮细胞受低氧刺激时，MALAT1表达升高。体外实验表明沉默MALAT1可抑制内皮细胞增殖同时促进其迁移，最终导致血管样结构形成紊乱。同时体内实验证实敲除MALAT1小鼠新生视网膜血管形成障碍，且与多种关键细胞周期调控基因表达谱改变显著相关[16]。此外，在心肌细胞中，MALAT1来源的mascRNA能与抗病毒靶位点结合，促进肿瘤坏死因子-α、白介素-6等表达，从而发挥抗柯萨奇病毒B3的功能[17]。

注：promoter：启动子

3 尿路上皮癌相关1

3.1 尿路上皮癌相关1与Wnt/β-catenin信号通路的研究进展

Wang等在人膀胱移行细胞癌中分离鉴定出尿路上皮癌相关1(urothelial carcinoma associated 1，UCA1)。UCA1位于19p13.12，5’端有TATA框，3’端有多聚腺苷酸和加尾信号。UCA1在绒毛组织、胎盘组织、胎儿心脏及成人心脏中均有较高表达，这提示UCA1在胎儿生长发育及成人心血管功能调节中发挥重要作用。

UCA1能通过激活Wnt/β-catenin信号通路而参与肿瘤进程。在口腔鳞癌中，UCA1表达升高，与淋巴结转移及TNM分期有关，并通过激活Wnt/β-catenin信号通路而促进肿瘤细胞增殖及转移[18]。在乳腺癌中，UCA1通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进EMT从而调控癌细胞迁移及侵袭[19]。EMT是指上皮细胞向间充质细胞转变并获得迁移能力的过程，在胚胎早期发育、器官形成以及心脏瓣膜构建中均发挥不可或缺的作用[20]。这些研究提示MALAT1及在胎儿心脏中高表达的UCA1可能与Wnt/β-catenin信号通路形成调节网络调控胚胎发育。

3.2 UCA1与心血管系统疾病的关系

UCA1与缺血性心肌病密切相关。研究报道缺血再灌注损伤中，活性氧大量产生导致心肌组织中UCA1下降，下游P27含量升高从而激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3，引起细胞凋亡[21]。此外，血浆中UCA1在急性心肌梗死发生3 d内降低，3 d后含量升高，且与微小RNA(microRNA，miR)-1呈负相关[22]。同时，有研究报道miR-1具有抑制UCA1表达的功能[23]。这些研究提示UCA1通过与miR-1作用从而调节急性心肌梗死病理生理过程，也能作为辅助诊断急性心肌梗死的潜在生物标志物。

4 H19

4.1 H19与Wnt/β-catenin信号通路的研究进展

H19基因是首个被发现的母源印记基因，包括5个外显子和4个内含子。在脊椎动物胚胎发育时期，H19高表达于内胚层及中胚层源性组织，其异常的甲基化状态可导致先天性疾病如BWS(Beckwith-Wiedemann syndrome)和SRS(Silver-Russell syndrome)的发生。然而在出生后，仅低表达于心肌及骨骼肌，这提示H19对肌肉生长分化十分重要[24]。H19基因可生成一段没有开放阅读框的RNA，即lncRNA H19，长约2.3 kb，主要位于细胞质内，以调节性RNA或者核糖调节子的方式发挥其生物学功能。

随后的研究发现lncRNA H19可通过调控Wnt/β-catenin信号通路而参与肿瘤进程及骨形成过程。 Wu等[25]发现对甲氨蝶呤不敏感的结肠癌细胞系中H19表达增加。进一步实验证实沉默H19后，Wnt/β-catenin信号通路被抑制，提高了肿瘤对甲氨蝶呤的敏感性。 Luo等[26]发现H19表达水平与膀胱癌的转移情况也有密切联系。H19高表达患者膀胱癌转移率高。进一步的分子机制研究表明H19可使Nkd1基因启动子区具有组蛋白甲基转移酶活性的果蝇zeste基因增强子人类同源物2作用增强，使其H3K27me3表达水平上调，抑制Nkd1基因的表达，从而激活下游Wnt/β-catenin信号通路，下调钙黏蛋白E的表达，促进膀胱癌转移。这些研究均提示H19可作为预测肿瘤转移的生物标志物，为新型化疗药物的研制奠定基础。Liang等在骨形成过程中也发现了H19的身影。体内及体外实验均证实表达上调的H19可促进成骨细胞的分化。Liang等[27]深入研究发现过表达的H19可拮抗miR-141和miR-22，解除对β-catenin的抑制，最终激活Wnt/β-catenin信号通路，促进骨形成。该研究阐明了H19对于骨形成有重要意义。

4.2 H19与心血管系统疾病的关系

H19与心血管系统疾病及心脏发育也有着密不可分的关系。Fayez等利用RNA测序及全基因组DNA甲基化分析技术，发现在钙化性主动脉瓣疾病中lncRNA H19表达水平升高，且与其启动子区低甲基化有关。敲除及过表达实验均表明H19可通过调节与细胞分化、增殖密切相关的NOTCH1通路促进瓣膜钙化。随后该研究团队通过基因启动子分析发现H19可通过抑制NOTCH1基因启动子区p53的募集从而沉默NOTCH1。在瓣膜间质细胞中，敲除H19可使NOTCH1表达增加，抑制其下游促进钙化的Runt相关转录因子2及BMP2基因的表达。在补救实验中，过表达NOTCH1可抑制H19诱导的钙化。该研究证实了在钙化性主动脉瓣疾病中，H19基因启动子区的低甲基化可使lncRNA H19表达上调，干扰NOTCH1的表达从而促进瓣膜钙化[28]。Tao等[29]在研究H19与心肌纤维化的关系时发现，过表达的H19可促进心脏成纤维细胞增殖及纤维化。而敲除H19后，其下游双特异性蛋白磷酸酶5/细胞外调节蛋白激酶1/2轴基因表达水平发生改变，心脏成纤维细胞的增殖及纤维化受到抑制。Han等[30]发现在心脏分化晚期H19对于调控细胞增殖、凋亡，维持正常的心脏发育及功能也有重要意义。下调其表达后，miR-19b表达上调，其下游核转录因子Sox6表达水平增加从而促进细胞增殖，抑制细胞凋亡。过表达Sox6后可挽救H19敲除对心脏分化的影响。上述研究结果提示H19可成为治疗先天性心脏病和缺血性心肌病等的新靶点。

5 总结与展望

目前关于lncRNAs的研究方兴未艾，仍有大量未知的lncRNAs有待发掘。Wnt/β-catenin信号通路在心脏发育、心血管系统疾病以及肿瘤迁移、侵袭中均发挥重要的调控作用。LncRNAs与Wnt/β-catenin信号通路有着密切联系，存在着大量交叉信号分子，其具体作用靶点、机制都值得深入的研究。虽然异常表达的lncRNAs能通过Wnt/β-catenin信号通路影响多种肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移等生物学行为，调节心血管系统疾病的发生；但lncRNAs能否与Wnt/β-catenin作用而参与胚胎心脏发育尚不明确。在心血管疾病中发挥重要作用的lncRNAs与Wnt/β-catenin信号通路的联系可能为先天性心脏病的研究提供新的理论依据和实验线索，也为先天性心脏病的治疗提供了新的思路。

[ 参 考 文 献 ]

[1] Rinn JL,Kertesz M,Wang JK,et al.Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs[J].Cell,2007,129(7):1311-1323.

[2] Wu L,Murat P,Matak-Vinkovic D,et al.Binding interactions between long noncoding RNA HOTAIR and PRC2 proteins[J].Biochemistry,2013,52(52):9519-9527.

[3] Ge XS,Ma HJ,Zheng XH,et al.HOTAIR,a prognostic factor in esophageal squamous cell carcinoma,inhibits WIF-1 expression and activates Wnt pathway[J].Cancer Sci,2013,104(12):1675-1682.

[4] Li J,Yang S,Su N,et al.Erratum to:overexpression of long non-coding RNA HOTAIR leads to chemoresistance by activating the Wnt/beta-catenin pathway in human ovarian cancer[J].Tumour Biol,2015,36(11):9093-9094.

[5] Carrion K,Dyo J,Patel V,et al.The long non-coding HOTAIR is modulated by cyclic stretch and WNT/beta-CATENIN in human aortic valve cells and is a novel repressor of calcification genes[J].PLoS One,2014,9(5):e96577.

[6] Greco S,Zaccagnini G,Perfetti A,et al.Long noncoding RNA dysregulation in ischemic heart failure[J].J Transl Med,2016,14(1):183.

[7] 曾春雨,杨渝佳,蔡越,等.血浆HOTAIR在冠状动脉粥样硬化性心脏病的表达及诊断价值[J].现代生物医学进展,2015,15(14):2617-2620.

[8] Wu H,Liu J,Li W,et al.LncRNA-HOTAIR promotes TNF-alpha production in cardiomyocytes of LPS-induced sepsis mice by activating NF-kappaB pathway[J].Biochem Biophys Res Commun,2016,471(1):240-246.

[9] Tripathi V,Ellis JD,Shen Z,et al.The nuclear-retained noncoding RNA MALAT1 regulates alternative splicing by modulating SR splicing factor phosphorylation[J].Mol Cell,2010,39(6):925-938.

[10] Zhang JH,Kang XH,Lu P,et al.Expression of long non-coding RNA MALAT1 in osteosarcoma and its effect on invasiveness and metastatic potential of osteosarcoma cells[J].Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi,2016,45(8):561-565.

[11] Ji Q,Liu X,Fu X,et al.Resveratrol inhibits invasion and metastasis of colorectal cancer cells via MALAT1 mediated Wnt/beta-catenin signal pathway[J].PLoS One,2013,8(11):e78700.

[12] Liang J,Liang L,Ouyang K,et al.MALAT1 induces tongue cancer cells' EMT and inhibits apoptosis through Wnt/beta-catenin signaling pathway[J].J Oral Pathol Med,2017,42(2):98-105.

[13] Zhao Y,Yang Y,Trovik J,et al.A novel wnt regulatory axis in endometrioid endometrial cancer[J].Cancer Res,2014,74(18):5103-5117.

[14] Gupta RA,Shah N,Wang KC,et al.Long non-coding RNA HOTAIR reprograms chromatin state to promote cancer metastasis[J].Nature,2010,464(7291):1071-1076.

[15] Zhao J,Li L,Peng L.MAPK1 up-regulates the expression of MALAT1 to promote the proliferation of cardiomyocytes through PI3K/AKT signaling pathway[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8(12):15947-15953.

[16] Michalik KM,You X,Manavski Y,et al.Long noncoding RNA MALAT1 regulates endothelial cell function and vessel growth[J].Circ Res,2014,114(9):1389-1397.

[17] Gast M,Schroen B,Voigt A,et al.Long noncoding RNA MALAT1-derived mascRNA is involved in cardiovascular innate immunity[J].J Mol Cell Biol,2016,8(2):178-181.

[18] Yang YT,Wang YF,Lai JY,et al.Long non-coding RNA UCA1 contributes to the progression of oral squamous cell carcinoma via regulating WNT/beta-catenin signaling pathway[J].Cancer Sci,2016,107(11):1581-1589.

[19] Xiao C,Wu CH,Hu HZ.LncRNA UCA1 promotes epithelial-mesenchymal transition(EMT)of breast cancer cells via enhancing Wnt/beta-catenin signaling pathway[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci,2016,20(13):2819-2824.

[20] von Gise A,Pu WT.Endocardial and epicardial epithelial to mesenchymal transitions in heart development and disease[J].Circ Res,2012,110(12):1628-1645.

[21] Liu Y,Zhou D,Li G,et al.Long non coding RNA-UCA1 contributes to cardiomyocyte apoptosis by suppression of p27 expression[J].Cell Physiol Biochem,2015,35(5):1986-1998.

[22] Yan Y,Zhang B,Liu N,et al.Circulating long noncoding RNA UCA1 as a novel biomarker of acute myocardial infarction[J].Biomed Res Int,2016,2016(1):1-7.

[23] Wang T,Yuan J,Feng N,et al.Hsa-miR-1 downregulates long non-coding RNA urothelial cancer associated 1 in bladder cancer[J].Tumour Biol,2014,35(10):10075-10084.

[24] Thorvaldsen JL,Duran KL,Bartolomei MS.Deletion of the H19 differentially methylated domain results in loss of imprinted expression of H19 and Igf2[J].Genes Dev,1998,12(23):3693-3702.

[25] Wu KF,Liang WC,Feng L,et al.H19 mediates methotrexate resistance in colorectal cancer through activating Wnt/beta-catenin pathway[J].Exp Cell Res,2017,350(2):312-317.

[26] Luo M,Li Z,Wang W,et al.Long non-coding RNA H19 increases bladder cancer metastasis by associating with EZH2 and inhibiting E-cadherin expression[J].Cancer Lett,2013,333(2):213-221.

[27] Liang WC,Fu WM,Wang YB,et al.H19 activates Wnt signaling and promotes osteoblast differentiation by functioning as a competing endogenous RNA[J].Sci Rep,2016,6:20121.

[28] Hadji F,Boulanger MC,Guay SP,et al.Altered DNA methylation of long noncoding RNA H19 in calcific aortic valve disease promotes mineralization by silencing NOTCH1[J].Circulation,2016,134(23):1848-1862.

[29] Tao H,Cao W,Yang JJ,et al.Long noncoding RNA H19 controls DUSP5/ERK1/2 axis in cardiac fibroblast proliferation and fibrosis[J].Cardiovasc Pathol,2016,25(5):381-389.

[30] Han Y,Xu H,Cheng J,et al.Downregulation of long non-coding RNA H19 promotes P19CL6 cells proliferation and inhibits apoptosis during late-stage cardiac differentiation via miR-19b-modulated Sox6[J].Cell Biosci,2016,6(1):58.