木瓜蛋白酶酶解豌豆蛋白挤出物产物自由基清除活性评价

王 琪, 李 慧,陆文伟,周泉城

(1.山东理工大学 农业工程与食品科学学院 ，山东 淄博 255049；2.山东理工大学 农产品功能化技术山东省高校重点实验室，山东 淄博 255049)

挤压技术具有生产成本低、生产率高、能量损耗低、功能种类多的优点. 挤压过程中，在温度、压力和剪切力作用下，豌豆蛋白会发生化学键的断裂、重新结合、大分子失去原有的结构、小分子发生聚合或降解等，从而使原料的生物活性、理化性质和营养价值发生变化[4-6]. 在挤压过程中，在温度、压力和剪切力的作用下，维持蛋白质结构的作用力减弱，分子结构发生伸展，由球状转为纤维状，并使分子间氢键、二硫键等化学键断裂[7]. 经过挤压之后，蛋白质内部的疏水性基团暴露，蛋白质交联作用加剧，使得一些共价键生成. 此外，挤压后的物料游离氨基的含量增加，使得挤出物的消化率升高，蛋白质的酶解速度加快[7]. 因此，研究挤压、特别是酶联合挤压过程中豌豆蛋白的结构变化具有重要意义，并可为豌豆蛋白的后续加工提供理论指导和技术参数.

1 材料与方法

1.1 试验材料

木瓜蛋白酶购自济宁元素高科生物科技有限公司，木瓜蛋白酶的酶活力为50 234 u/g. 豌豆蛋白购自烟台双塔食品股份有限公司，主要组成(质量分数)为水分4.62±0.02%，蛋白质73.2±0.23%，粗脂肪0.22±0.01%，灰分4.62±0.03%，此蛋白为原料豌豆蛋白，简称为豌豆蛋白.

1.2 实验仪器

单螺杆挤压机由山东理工大学农业工程与食品科学学院研制，单螺杆挤压机的长径比是16.7.

1.3 试验操作

1.3.1 豌豆蛋白的挤压处理

称取2 kg豌豆蛋白粉，含水率25%. 挤压条件如下：机筒温度60℃，螺杆转速170 r/min，模孔孔径12 mm. 挤出物冷却、干燥、粉碎，100目筛选，装袋储存，称为豌豆蛋白挤出物.

1.3.2 豌豆蛋白挤出物的酶解

称取一定质量的豌豆蛋白和由节1.3.1得出的豌豆蛋白挤出物样品，加入一定质量的木瓜蛋白酶和一定pH值的磷酸盐缓冲溶液，摇匀，置于恒温振荡水浴锅中，振荡酶解3 h，结束后，沸水浴灭酶10 min. 冷却后，将木瓜蛋白酶解液过滤，滤液称为酶解物.

1.4 抗氧化活性响应曲面实验设计

查阅相关资料及文献可发现加酶量、温度、pH、底物浓度为影响酶解条件的4个显著因素，因此，选择此4个因素为实验因素. 通过预实验研究大致确定实验因素的用量范围，利用抗氧化活性作为评判指标，确定显著用量范围进而得出实验因素的5个水平，运用SAS 9.1软件进行实验设计分析，得出最佳的酶解条件.实验设计及结果见表1.

表1 响应面实验设计及结果Tab.1 Response surface experimental data

1.5 酶解产物抗氧化活性研究

1.5.1 DPPH清除率的测定

根据Dike Teng[8]的方法，加以改动. 实验组取滤液1 mL，加入试管中. 并加入4 mL浓度为0.1 mol/L的DPPH溶液，其中DPPH溶液用体积分数为95%乙醇：蒸馏水=1∶1的混合溶液作为溶剂配制. 避光静置30 min后，在517 nm下测定吸光度(Asample).

对照组以1 mL的蒸馏水代替滤液，实验步骤与上述相同(Acontrol). 空白组以体积分数为95%乙醇：蒸馏水=1∶1的混合溶液来代替DPPH溶液，实验步骤与上述相同(Ablank). 参比为1 mL蒸馏水和4 mL的5%乙醇：蒸馏水=1∶1的混合溶液. 计算公式如下：

清除率%=

[1-(Asample-Ablank)/Acontrol]×100%

1.5.2 OH清除率的测定

采用邻二氮菲法[9]，做适当修改. 实验组取2 mL滤液于试管中，加入2 mL的0.02mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH为7.4)，再加入1 mL1.8 mM的邻二氮菲溶液和1 mL 1.8 mmol/L的FeSO4水溶液，迅速混匀. 最后在混合液中加入1 mL体积分数0.02%的双氧水，于37℃下水浴60 min，冷却后在536 nm下测定吸光度，记为As.

对照组以蒸馏水代替滤液，实验步骤与上述相同(Ac). 空白组用蒸馏水代替滤液和双氧水，实验步骤与上述相同(Ab). 参比为5 mL的磷酸盐缓冲溶液与2 mL蒸馏水的混合溶液. 计算公式如下：

清除率%=[(As-Ac)/(Ab-Ac)]×100 %

1.6 数据分析

每个操作3次平行，利用SAS 9.1软件建立回归模型方程，对数据进行ANOVA分析，Duncan test确定平均值差异.

2 结果与分析

2.1 木瓜蛋白酶酶解豌豆蛋白挤出物抗DPPH清除率实验

以DPPH清除率为响应值，经回归拟合后，木瓜蛋白酶酶解豌豆蛋白挤出物的DPPH清除率的回归方程为：

DPPH清除率=-292+3.37A+4.29B+61.3C+12.5D+0.009AB+0.0506AC+0.297×AD+0.0643BC-0.0689BD+0.0663CD-0.259A2-0.0363B2-5.13C2-0.897D2.

木瓜蛋白酶酶解豌豆蛋白挤出物的DPPH清除率的回归方程方差分析表，见表2.

由表2可知，所建模型是显著的，失拟项是不显著的. 且加酶量(A)和pH的交互项(AC)影响显著，加酶量的二次项(A2)、温度的二次项(B2)、pH二次项(C2)、底物浓度的二次项(D2)的影响极显著. 由F值可知，各因素对豌豆蛋白挤出物酶解液DPPH清除率的影响次序：pH>底物浓度>加酶量>酶解温度. 加酶量和底物浓度对酶解度的交互作用比其他交互作用更明显. 赵翊君等[10]研究了辣木籽酶解产物的DPPH清除能力，研究证明了蛋白酶解产物具有较强的DPPH清除率. 本研究的结果与赵翊君等的研究结果相一致. 根据回归方程作各因素及其交互作用对DPPH清除率影响的响应曲面图见图1.

表2 DPPH清除率方差分析Tab.2 Variance analysis for the scavenging rate of DPPH

通过响应曲面图1，可以进一步看出加酶量、pH、温度、底物浓度，任何2个因素对DPPH清除率的交互影响. 由图1可以看出各因素存在极值点，即有最优值，且各因素的相应曲面图在底面的投影呈圆形或椭圆形，极值点落于圆心处，说明4个因素的水平值选择合理，验证了实验的准确性.

图1 DPPH清除率响应曲面图Fig. 1 Response surface plot of the scavenging rate of DPPH

2.2 木瓜蛋白酶酶解豌豆蛋白挤出物·OH清除率实验

以·OH清除率为响应值，经回归拟合后，木瓜蛋白酶酶解豌豆蛋白挤出物的·OH清除率的回归方程为：

·OH 清除=-2637+84.5A+19.1B+389C+102D-0.275AB+0.009AC-0.584AD-0.301BC-0.061BD+1.16CD-2.66A2-0.107B2-29.3C2-6.99D2.

木瓜蛋白酶酶解豌豆蛋白·OH清除率的回归方程方差分析表，见下表3.

表3 ·OH清除率方差分析Tab.3 Variance analysis for the scavenging rate of ·OH

由表3可知，所建模型是显著的，失拟项是不显著的. 加酶量的二次项(A2)、pH的二次项(C2)、底物浓度的二次项(D2)影响极显著. 由F值可知，各因素对豌豆蛋白挤出物酶解液·OH清除率的影响次序：pH>底物浓度>酶解温度>加酶量. 这与马萨日娜的研究结果相一致[11]. 根据回归方程作各因素及其交互作用对·OH清除率影响的响应曲面图见图2.

图2 各因素对·OH清除率的响应曲面图Fig. 2 Response surface plot of the scavenging rate of ·OH

通过响应曲面图2，可以进一步看出加酶量、pH、温度、底物浓度，任何2个因素对·OH清除率的交互影响. 由图2可以看出各因素存在极值点，即有最优值，且在底面的投影呈圆形或椭圆形，极值点落于圆心处，说明4个因素的水平值选择合理，验证了实验的准确性. ·OH清除率随着底物浓度的增加而增加最终趋于平缓；而随着加酶量、pH、温度的升高先升高后降低.

2.3 木瓜蛋白酶酶解豌豆蛋白挤出物抗氧化最佳酶解条件

以DPPH清除率、·OH清除率为评价指标，对回归方程进行偏微分，得出最佳酶解条件：加酶量12.1%、温度60.6℃、pH6.50、底物浓度0.071g/mL.

2.4 验证实验

经验证，在节2.3最佳酶解条件下，得到最佳DPPH清除率、·OH清除率分别为98.2±0.21%、84.5±0.15%，与在此条件下预测值DPPH清除率、·OH清除率分别为98.3%、84.7%方差分析无显著性差异. 这说明该模型预测准确，可用于豌豆蛋白挤出物抗氧化性预测及酶解条件筛选.

3 结束语

经以上实验操作及软件分析可得出木瓜蛋白酶酶解豌豆蛋白挤出物最佳酶解条件：加酶量12.1%、温度60.6℃、pH6.50、底物浓度0.071g/mL. 此条件下，DPPH清除率、·OH清除率预测值分别为98.3%、84.7%，与验证结果相符.该模型预测准确可靠，可用于豌豆蛋白的生产预测和工艺开发.

[1]张树成, 李玉林. 制取豌豆分离蛋白及淀粉的工艺研究[J]. 农产品加工学刊, 2012(7): 77-80.

[2]孙旭. 挤压玉米蛋白粉酶法生物活性肽制备及特性[D]. 哈尔滨：东北农业大学, 2013.

[3]高群玉, 周俊侠. 豌豆淀粉颗粒性质的研究[J]. 粮食与饲料工业, 1998(6): 41-42.

[4] 张艳荣, 周清涛, 张传智, 等. 响应面法优化玉米蛋白挤出工艺[J]. 食品科学, 2011, 32(14): 72-78.

[5] 孙照勇. 植物蛋白复合挤压组织化特性研究[D]. 北京：中国农业科学院, 2009.

[6] 母应春, 解春芝, 杨夫光, 等. 加酶挤压碎米生产淀粉糖浆工艺优化[J]. 食品科技, 2014, 39(7): 163-167.

[7]高福成. 现代食品工程高新技术[M]. 北京: 中国轻工业出版社, 1997.

[8]ALONSOR,ORUEE,ZABALZAMJ,etal.Effectofextrusioncookingonstructureandfunctionalpropertiesofpeaandkidneybeanproteins[J].JournaloftheScienceofFoodandAgriculture, 2000, 80(2): 397-403.

[9]CHAIYAKULS,JANGCHUDK,JANGCHUDA.Effectofextrusionconditionsonphysicalandchemicalpropertiesofhighproteinglutinousrice-basedsnack[J].LWT-FoodScienceandTechnology, 2009, 42(3): 781-787.

[10]赵翊君，刘华勇，陈森林，等. 辣木籽酶解产物的蛋白质回收率及DPPH清除能力研究[J/OL]. 现代食品科技2017(2017-10-11).http://kns.cnki.net/kcms/detail/44.1620.TS.20171011.1108010.html.

[11]马萨日娜. 裸燕麦总蛋白、谷蛋白酶解物的功能特性及其抗氧化活性研究[D]. 呼和浩特：内蒙古农业大学, 2015.