四妙勇安汤对大鼠尾动脉血管吻合术后吻合口再狭窄及VEGF蛋白的影响*

2018-06-04雷儒萌

中国中医急症 2018年4期

刘鑫雷儒萌欧梁△

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙 410007；2.湖南中医药大学，湖南长沙410208）

断指再植是手外科常见急诊手术，是指借助显微外科技术将离断肢体的血管、骨、神经、肌腱及皮肤进行重建，以最大程度恢复肢体的循环、外形及功能的一种治疗手段。令人欣慰的是我国创伤显微外科技术在全球处于领先水平，据文献报道，我国断指再植成活率达90%以上［1]。但是作为一名手外科医师，应该更加重视那些因再植手术失败而承受肢体缺失痛苦的患者。研究发现［2]，血管吻合术后吻合口再狭窄是导致手术失败的重要原因，因此，如何抑制吻合口再狭窄机制的发生以提高血管吻合通畅率是现代显微外科医师的重大课题。四妙勇安汤始见于华佗《神医秘传》之中，临床常用于治疗热毒炽盛所致的血栓闭塞性脉管炎、静脉炎等血脉疾患。本课题组试从中医络病学角度进行探索，将断指再植术后辨病为“络病”范围，确立 “清热解毒，活血通络”的基本治法，选用四妙勇安汤为研究方药，探讨其对大鼠尾动脉血管吻合术后吻合口再狭窄、血管内膜增生情况及血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响，从而为临床实践提供理论支持。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物健康的雄性成年SD大鼠共27只，月龄12周，体质量220～250 g，SPF级。由湖南中医药大学动物实验中心提供［许可证号：SYXK（湘）2013-0005]。实验室温度处于22～26℃，湿度45%～65%之间，整个试验经湖南中医药大学动物实验伦理委员会同意和审查。

1.2 试药与仪器 1）试药：四妙勇安汤生药（金银花、玄参、当归、甘草）均由湖南中医药大学第一附属医院中药房提供，按原方比例 3∶3∶2∶1 抓取，将生药全部浸入清水之中，等待其浸泡0.5 h后开始煎煮，头次煎煮时间1 h，煎煮过滤后留取药汁备用，再次煎煮1 h，过滤后留取药汁，将两次煎煮药汁混合，再通过离心机去沉渣，去沉渣后的药汁，经80℃水浴锅蒸发浓缩处理，制备药汁生药含量为4.5 g/mL的中药汤剂，冷藏保存备用。0.9%氯化钠注射液（湖南科伦制药有限公司，批号H16102701）；水合氯醛（天津市大茂化学试剂厂，批号 H20151207）；肝素钠注射液（南京健友生化制药股份有限公司，批号H20153024）；枸橼酸盐缓冲液（Wellbio，批号 H20158403）；二步法试剂盒（中杉金桥，批号 H20152433）；DAB试剂盒（中杉金桥，批号H20156213）。2）仪器：DYY-6C型恒温箱（北京六一公司）；TS-92型摇床（海门其林贝尔公司）；M199型切片刀（德国莱卡公司）；YD-315型切片机（浙江金华益迪试验设备公司）；BA210T型显微镜（Motic公司）；BMJ-A型包埋机（常州中威电子仪器公司）。

1.3 实验方法雄性成年SD大鼠共24只，适应性喂养1周后按照随机数字表以1∶1的比例分为四妙勇安汤组和生理盐水组。参考文献［3-4]的造模方法，并结合本次实验特点，造模步骤如下：造模前预先配置标准10%水合氯醛溶液及肝素盐水，按0.35 mL/100 g的麻醉用药剂量腹腔注射麻醉。麻醉成功后，将大鼠置于固定台，采取仰卧位.按照无菌手术原则消毒铺巾，取大鼠尾部腹侧正中距尾根约2 cm处作腹侧纵形切口，切口长度约2 cm，逐层在10倍手术显微镜下使用专用显微手术器械分离大鼠尾部腹侧正中结缔组织以及动脉鞘，充分显露、游离大鼠尾部腹侧正中尾动脉，显露游离好后，选用两枚无创血管夹，分别夹住血管的近心端、远心端阻断血流，再用锐利的显微外科剪垂直横断血管。血管离断后，显露血管断端，运用预先配置的肝素盐水冲洗血管管腔并予以液压扩张管腔，其后术中间断使用肝素盐水冲洗以清晰视野，修剪外膜后将两枚无创血管夹稍合拢，根据血管直径选择粗细适宜的9-0至11-0无创缝合线，在无张力的情况下将离断血管端-端内膜外翻吻合，吻合后对吻合血管进行血管充盈试验，确认其通血成功，再轻柔操作闭合创口，待大鼠清醒，观察无异常反应后放回饲养笼中。两组均在术后12 h灌胃，四妙勇安汤以2mL/只的剂量灌胃，对照组予以等剂量0.9%氯化钠注射液灌胃，两组灌胃均每日2次，于术后第3日、第7日，末次灌胃2 h后，分批留取吻合口处血管组织标本并断头处死动物，两个时间段每组大鼠各6只。

1.4 标本采集与检测 1）HE染色观察血管组织形态学变化。取大鼠腹侧正中尾动脉血管吻合部位附近长约1 cm血管组织，及时置入4%多聚甲醛溶液之中浸泡固定。待组织标本在用不同梯度的乙醇中脱水后，置于石蜡中包埋、切片，行HE染色并镜下观察。2）免疫组织化学染色检测组织中VEGF的表达。将制备好的切片进行60℃烤片，时间为30～60 min，拷片后的切片进行脱蜡以及水化处理，再热修复抗原，再之后加入预先备好的3%H2O2溶液，在室温之下等待10min以灭活血管组织标本的内源性活性酶。孵育一抗：滴加适当稀释的一抗（VEGF），在4℃的环境之中过夜。PBS液体冲洗5 min×3次，孵育二抗：再滴加50～100μL鼠IgG抗体-HRP多聚体处理，37℃的环境之中孵育30 min，PBS液体冲洗5min×3次。经过以上处理后滴加预先制备好待用的显色剂DAB液。再次运用苏木素处理，复染5～10min之后，运用大量蒸馏水冲洗，冲洗后再经PBS液体处理使颜色返蓝；最后再经过不同等级溶度的酒精（60%～100%）进行脱水处理，每级处理时间为5min。取出后将切片小心置入二甲苯之中，需要置入10 min，重复2次，之后再用中性的树胶进行封片处理，处理后置于显微镜下查看分析。阳性染色为黄色或棕黄色（深的可至褐色）染色。3）图像分析处理。采用图像分析软件IPP6.0（Image-Pro-Plus 6.0）分析镜下摄像，计算出血管横断面管腔面积（LA）、内弹力板包绕面积（IELA）、外弹力板包绕面积（EELA），再计算出内膜面积（IA）=IELA–LA；增生面积（PA）=EELALA；以PA/EELA比值评估管腔狭窄程度。

1.5 统计学处理应用SPSS17.0统计软件。计量资料以（±s）表示，资料满足正态性与方差齐性，采用配对t检验，不满足则采用非参数检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色及血管内膜增生情况结果分析见图1，图2，表1。镜下观察到大鼠尾动脉血管壁内、中、外3层层次分明（图1）。经IPP 6.0处理获得的内膜面积数据资料发现，与对照组比较，实验组在术后第3日、第7日的血管内膜面积都明显增加，差异性均有统计学意义（P＜0.05）（见表 1，图 2），说明四妙勇安汤在血管吻合修复术后能有效促进血管内膜增生修复。

图1 大鼠尾动脉吻合口血管（HE染色，400倍）

图2 各项测量指标结果

表1 两组不同时间段血管内膜各项测量指标结果比较（±s）

与生理盐水组比较，*P＜0.05。

组别时间血管组织VEGF蛋白表达（平均光密度值）血管内膜面积（μm2）血管腔狭窄程度（%）四妙勇安汤术后3 d 0.17±0.01*（n＝6）术后 7 d 0.20±0.01*生理盐水组术后3 d 0.13±0.01 2258.85±141.68* 58.81±1.77*2891.69±115.76* 64.26±1.18*1979.53±107.12 62.41±1.91（n＝6）术后 7 d 0.15±0.01 2420.60±106.15 66.58±1.62

2.2 各组管腔狭窄程度比较见表1，图2。以PA/EELA（%）的比值评估修复后血管腔狭窄程度。两组术后第3日、第7日的PA/EELA比值差异性比较均有统计学意义（P＜0.05），证明四妙勇安汤能有效预防血管吻合术后吻合口再狭窄。

2.3 免疫组化检测血管组织VEGF蛋白表达见表1，图2，图3。光镜下判断VEGF蛋白阳性表达为黄色或棕黄色（见图3），染色以平均光密度值评估VEGF蛋白的表达程度，与对照组比较，实验组在术后第3日、第7日的平均光密度值均明显增高（P＜0.05）（见表1，图2），表明四妙勇安汤能有效刺激VEGF蛋白的表达。

图3 大鼠尾动脉吻合口血管免疫组化（HE染色，400倍）

3 讨论

随着显微外科技术的发展，显微外科技术愈发成熟，手术成功率大为提升，但显微外科医生面对着血管吻合术后吻合口再狭窄导致血管吻合远期通畅率难以提高的状况仍然客观存在［5]。血管吻合术后吻合口再狭窄的发生是一个非常复杂的病理生理过程，其发生的过程可能涉及多种因子与多条信号转导通路的参与［6]。目前，西医对于血管吻合术后预防血管堵塞的治疗主要包括有：一般性治疗，如嘱患者卧床休息，防寒保暖，戒烟、戒酒，调节情志等；药物对症治疗，如应用抗凝、抗感染、抗痉挛、止痛等治疗药物，改善血管状态，保持血流通畅［7]。虽然这些治疗措施已经为血管的再通创造了较好条件，但是远期通畅率仍有待进一步提高。

因此，从中医络病学角度进行探索，为治疗血管吻合口再狭窄提供治疗手段，以提高血管损伤修复后通畅率，是非常必要的。血管损伤中医辨病为“络病”范围，络脉是人体气血津液运行输布的通道，在人体内纵横交贯遍布全身，形成一个网络系统，将人体脏腑、肢体等相互联系构成为一个有机的整体［8]。因此，可以将血管损伤发生的基本病机过程归纳总结为：邪气犯络，络道受邪，损伤络道，气血凝涩，输布环流受阻，而酿生毒瘀，毒侵络道，致邪盛于正，正气受损，络虚邪郁，致络脉瘀滞。基于对血管损伤中医病因病机的理解及深刻认识，确立“清热解毒，活血通络”为血管损伤的基本治则。

四妙勇安汤目前临床广泛用于治疗心血管及周围血管疾病，疗效确切［9-10]。本方由金银花、玄参、当归、甘草四味药组成，方中金银花为君药，被古人誉为是清热解毒的良药；玄参为臣药，具有滋阴泻火之效，与金银花配伍能辅助加强清热解毒的效应；当归为佐药，具有补血调经、化瘀活血通络之效；甘草为使药调和诸药，全方药味少，效用专，具有清热解毒、活血通络的作用。同时，现代药理研究已证实四妙勇安汤具有抗凝血、抑制血小板聚集、抗血栓形成、扩张血管、促进纤维蛋白溶解、保护血管、改善血流动力学指标、抗炎、抗氧化、稳定斑块和降脂等作用［11-12]。

本研究中，采用大鼠尾动脉完全离断后在显微镜下施行血管吻合术的方法造模，符合该病的发病机制。实验结果发现：以血管内膜面积评估血管内膜增生情况，在术后的第3日和第7日，四妙勇安汤组吻合口处血管内膜细胞增生更加迅速、稳定，说明四妙勇安汤可以促进损伤处血管的修复进程；以PA/EELA比值评估血管管腔狭窄程度，生理盐水组血管腔变得更为狭窄，阻塞血液运行，说明四妙勇安汤能有效预防血管吻合术后吻合口再狭窄；以平均光密度值评估VEGF蛋白表达程度，术后第3日、第7日的四妙勇安汤组血管中VEGF蛋白表达量上调，表明四妙勇安汤能有效刺激VEGF蛋白的生成。VEGF蛋白是一种能够特异性作用于血管内皮细胞的生物活性物质，可以促进血管内皮细胞进行有丝分裂、复制增殖，并提高血管的通透性，发挥生物学效应构建新生血管外基质，为血管新生提供良好环境［13-15]。

综上，四妙勇安汤通过清热解毒，活血通络，可以促进大鼠损伤血管处血管内皮细胞增殖，加快血管修复，并能够刺激VEGF蛋白表达，从而预防吻合口再狭窄的发生。而且，四妙勇安汤预防血管吻合术后吻合口再狭窄其作用的发生可能是通过多种途径实现的，其具体的效应机制还需要进一步实验去证明。

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