L-肉碱在罗非鱼体内的药代动力学

2018-06-04罗志远杨淇龄武林华

水产科学 2018年3期

罗志远，周宇，杨淇龄，黄凯，唐笑，武林华

( 1.广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530000； 2.广西水产科学研究院，广西南宁 530000； 3.河池市水产畜牧局，广西河池 547000 )

吉富罗非鱼(Oreochromisniloticus，GIFT)生长速率快、遗传性状稳定、出肉率高，我国罗非鱼的人工养殖产量已经达到世界第一位。肉碱能提高鱼类的生产速率，提高成活率，减少脂肪肝的发生[1]。

目前，国内外关于肉碱在人体内的药代动力学研究已有报道[2-4]，且在血液透析患者体内L-肉碱水平研究上较为深入[5]。肉碱在水产畜牧饲料中的应用较普遍[6-8]，但肉碱在畜禽及水产动物体内的药代动力学研究鲜有报道。笔者就肉碱经口灌给药的方式下，对相同规格罗非鱼不同剂量肉碱及不同规格罗非鱼体内L-肉碱的药代动力学进行研究，以期为水产饲料中合理添加肉碱提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物及设计

试验对象为吉富罗非鱼，由南宁引育种中心提供，不同剂量试验组中罗非鱼体质量为(82.72±3.65) g，不同规格试验组中罗非鱼体质量分别为(82.72±3.65) g、(413.83±39.92) g，健康无伤病。饲养用水为充分曝气除氯的自来水，暂养及试验期间投喂全价颗粒料，日饲量为吉富罗非鱼初始体质量的2%，残饵用虹吸管吸出。试验期间持续充氧并对水体进行循环过滤，每日早晚投喂吉富罗非鱼配合饲料各1次，及时吸出残饵和粪便，每2 d换水1/2。给药与采样前 3 d 停饲，处理期间不投喂饲料，持续保持充气状态。

1.2 试剂及仪器

肉碱标准品(纯度99.0%，德国Dr.Ehrenstorfer公司)；鱼旺四号(肉碱)(纯度10%，杭州天农生物营养技术有限公司)；甲醇(色谱纯，Fisher Scientific公司)；乙腈(色谱纯，Merck公司)；三乙胺(色谱纯，天津市光复精细化工研究所)；柠檬酸(分析纯，天津市大茂化学试剂厂)；磷酸氢二钠(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)；磷酸二氢钾(分析纯，天津市博迪化工股份有限公司)；氧化银(分析纯，天津市科密欧化学试剂研发中心)；对溴苯乙酰基溴(p-BPB)(阿拉丁公司)；10%四丁基氢氧化铵(国药集团化学试剂有限公司)；肝素钠(南京新百药业有限公司)。

UltiMate 3000高效液相色谱系统 (包括双泵3200A，手动进样器 3200，恒温柱温箱 330，可见波长检测器 3400RS)(Chromeleon戴安中国有限公司)；精密电子天平[豪斯仪器(上海)有限公司]；高速台式离心机(Sigma 公司)；Vortex-Genie 2型漩涡混合器(美国 Scientific Industries公司)；HW-100型恒温水浴箱(南京泰斯特试验设备有限公司)；5200DT型超声清洗机(宁波新芝生物科技有限公司)。

1.3 溶液配制

L-肉碱贮备液：精密称取肉碱标准品 16.1 mg，10 mL双蒸水溶解，配制成10 mmol/L的肉碱储备液，4 ℃保存备用，以此配制肉碱标准溶液。

衍生剂配制：精确称取对溴苯乙酰基溴(p-BPB)40 mg于试管中，依次加入乙腈1 mL、10%四丁基氢氧化铵100 μL，充分混匀，注意只能在当日使用，避光存放。蛋白沉淀剂：乙腈∶甲醇=9∶1 (体积比)。

磷酸二氢钾和氧化银混合物：磷酸二氢钾∶氧化银混合物=9∶1 (质量比)。

柠檬酸缓冲液的配置：称取1.89 g柠檬酸 (C6H8O7·H2O) 于烧杯中，加入约400 mL超纯水溶解混匀后，再加入超纯水定容至500 mL。

1.4 给药与样品前处理

将试验鱼分为(82.72±3.65) g组和(413.83±39.92) g组，再将(82.72±3.65) g鱼随机分为12 mg/kg剂量组和120 mg/kg剂量组；(82.72±3.65) g规格120 mg/kg剂量组，按120 mL/kg鱼质量剂量灌药，而(413.83±39.92) g规格12 mg/kg剂量组，按12 mg/L剂量灌药。以上3个试验组每组约有180尾鱼。再将每个试验组分为15个小组，每小组有10尾鱼，口腔灌药给药。具体操作为：将药品摇匀后，用长10 cm软胶管自鱼口插入胃中，用注射器将药物灌入鱼胃，无回吐者为试验对象保留。每组分为15个时间点采样。给药前，试验动物禁食3 d，分别于口灌前(0 h)和给药后0.083、0.13、0.20、0.25、0.33、0.5、1、2、4、8、12、24、36 h和48 h采样，用经肝素钠润洗的注射器自尾静脉采血1.0 mL，置于含0.1%肝素钠处理过的离心管中混匀，4000 r/min，离心15 min。分离血浆，置于冰箱中-20 ℃保存备测。每个时间点6尾鱼，做6个平行样。

1.5 样品测定方法

取空腹尾脉血3 mL，离心后取上清液300 μL，加1000 μL 10%甲醇—乙腈溶液，混匀后，加入400 mg无水磷酸氢二钠+氧化银(9∶1)和400 mg无水磷酸二氢钾，立即剧烈振摇5 min，8000 r/min离心5 min，吸取上清液600 μL再加入衍生化试剂50 μL混匀后，70 ℃水浴90 min。冷却后进样20 μL作HPLC分析。该法的标准曲线的线性范围是1～400 μmol/L，肉碱衍生物色谱峰面积与待测肉碱的浓度线性关系良好，标准曲线回归方程为：y=0.08376x+0.09663 (n=6，r2=0.9995)，回收率稳定为88.16%～101.48%，平均回收率为95.83%，日内变异系数为1.79%～5.56%，日间变异系数为9.83%～11.81%。

1.6 色谱条件及数据处理

色谱柱： Kromasil Sil 色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相配制：乙腈—柠檬酸缓冲液(90∶10，体积比)，每1 L流动相中含有 0.25 mL 三乙胺，在上机前流动相及样品均用0.45 μm 滤膜减压过滤；流速1.2 mL/min；柱温35 ℃；检测波长260 nm；进样量20 μL。

试验数据采用 SPSS 11.5 进行平均值和标准差的计算及标准曲线回归分析，用 Microsoft Office Excel 2003 绘制药—时曲线，采用WinNonlin 5.2软件非房室模型统计矩方法计算药动学参数和模型拟合。

2 结果与分析

2.1 不同剂量肉碱在吉富罗非鱼血浆中的浓度

单次口灌肉碱后，罗非鱼血浆中药物浓度随时间变化情况见图1。两种剂量罗非鱼血浆中药物浓度变化趋势基本一致，即给药后药物浓度迅速上升，0.5 h达最大值；在达最大浓度后至4 h之间，药物浓度以较大的速率下降，4～12 h药物浓度下降速率稍慢。在12 h又明显升高形成第二个峰，至48 h时肉碱浓度分别为1.0 μmol/L和0.73 μmol/L。较高剂量组鱼血浆中的药物浓度高于较低剂量组。

图1 不同剂量单次口灌给药后罗非鱼体内肉碱的药—时曲线

2.2 不同剂量的肉碱在罗非鱼体内药代动力学比较

12 mg/kg和120 mg/kg剂量口灌单次给药，有关动力学数据经 WinNonlin 5.2 药代动力学软件分析非房室模型的统计矩方法得出药动学参数(表1)。12 mg/kg剂量的肉碱经口灌进入鱼体后，迅速进入吸收部位，血药浓度达峰时间为0.5 h，达峰浓度为21.27 μmol/L。其消除半衰期为8.73 h，鱼体对药物的总清除率为0.10 L/h·kg-1，曲线下面积为 96.95 μmol/h·L-1。120 mg/kg剂量组口灌给药肉碱的血药浓度达峰时间、达峰浓度、消除半衰期、表观分布容积、总体清除率、平均滞留时间分别为0.5 h、82.28 μmol/L、9.71 h、3.90 L/h·kg-1、0.28 L/h·kg-1、12.27 h。由表1可知，120 mg/kg剂量组的达峰浓度、药时曲线下面积显著高于12 mg/kg剂量组的达峰浓度和药时曲线下面积(P<0.05)，两者清除率和平均滞留时间差异不显著(P>0.05)。

表1 不同剂量肉碱单次口灌给药后在吉富罗非鱼体内的药动力学参数(n=6，平均值±标准差)

2.3 不同规格吉富罗非鱼血浆中肉碱的含量

以相同剂量12 mg/kg的肉碱口灌不同规格的罗非鱼后，罗非鱼血浆中药物浓度随时间变化情况见图2。由图2可知，(82.72±3.65) g鱼比(413.83±39.92) g的分布要稍快；(82.72±3.65) g鱼0.5 h时到达峰值19.95 μmol/L，而(413.83±39.92) g 0.5 h时达到峰值为(22.38±0.51) μmol/L，(82.72±3.65) g鱼峰浓度略低于(413.83±39.92) g；12 h时两组又形成第二峰，24 h时二者基本处于同一水平，分别为1.73 μmol/L和1.61 μmol/L，以后二者在同一水平上波动下降，至48 h时(82.72±3.65) g和(413.83±39.92) g罗非鱼血药浓度降至1.00 μmol/L和1.05 μmol/L。

图2 单次口灌给药后不同规格罗非鱼体内肉碱的药—时曲线

2.4 不同规格吉富罗非鱼血浆中肉碱的药代动力学比较

采用WinNonlin 5.2 药代动力学软件的非房室模型统计矩原理对试验数据进行分析，结果见表2，其中达峰时间、达峰浓度为实测值，药时曲线下面积用梯形法计算。由表2可知，(413.83±39.92) g鱼和(82.72±3.65) g鱼的达峰时间相同，(413.83±39.92) g消除相半衰期较长、峰浓度较高；而(82.72±3.65) g鱼的表观分布容积比(413.83±39.92) g大，说明肉碱在(82.72±3.65) g鱼体内的分布程度比(413.83±39.92) g鱼广泛；(413.83±39.92) g鱼清除率低于(82.72±3.65) g鱼，(82.72±3.65) g鱼的平均滞留时间比(413.83±39.92) g长。

表2 单次口灌给药后不同规格罗非鱼体内肉碱的药代动力学参数(n=6，平均值±标准差)

3 讨论

3.1 吉富罗非鱼体内药代动力学模型选择及特征

试验经过WinNonlin 5.2软件计算，得出统计矩参数，由于血药浓度—时间出现明显的多峰现象，而房室参数无法满足肉碱药代过程中客观描述的要求，对肉碱药代过程进行客观描述，因此本试验选择客观性较强的非房室模型进行分析。在大菱鲆(Scophthalmusmaximus)肌注和口灌恩诺沙星[9]，硫酸新霉素口灌吉富罗非鱼[10]和甲基睾丸酮口灌罗非鱼[11]的药时曲线符合房室模型参数。而甲磺酸达氟沙星口灌银鲫(Carassiusauratusgibelio)[12]，氟苯尼考、氟苯尼考胺口灌及肌注克氏原螯虾(Procambarusclarkii)[13]和褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)口灌噁喹酸[14]则采用了非房室模型统计矩参数进行分析，由此可见，药物种类及研究对象不同影响房室模型的拟合。房室模型拟合的优点是将复杂的生物问题简单化，将其作为一种数据分析的手段推导出药动学参数，为临床用药提供了基本规律。

本试验表明，肉碱剂量120 mg/kg时(82.72±3.65) g鱼组肉碱在罗非鱼体内的分布最广和肉碱在人体内(药时曲线下面积为3738.93 mmol·h/L、2284.27 μmol·h/L)报道不一致[15]，这可能与试验动物和给药剂量等有关。

试验结果表明在口灌给药的方式下，12 mg/kg剂量(82.72±3.65) g鱼组和120 mg/kg剂量(82.72±3.65) g鱼组及12 mg/kg剂量(413.83±39.92) g组表观分布容积为1.29 L/kg、3.9 L/kg、1.08 L/kg，大于1.0 kg/L，说明肉碱有较强的组织穿透性。

口灌给药下，以相同的剂量给药，比较肉碱在未成熟(82.72±3.65) g鱼和(413.83±39.92) g罗非鱼体内药动学差异显示。试验结果显示，(82.72±3.65) g鱼和(413.83±39.92) g鱼达峰时间均为0.5 h，但(82.72±3.65) g鱼消除半衰期、清除率分别为8.73 h、0.10 L/kg·h-1；(413.83±39.92) g鱼的半衰期、清除率分别为7.91 h、0.095 L/kg·h-1，可见(413.83±39.92) g鱼消除速率较快。笔者认为造成不同规格罗非鱼对肉碱消除速度差异的原因可能是(413.83±39.92) g鱼的肾脏排泄功能发育较未成熟(82.72±3.65) g鱼完全，亦或(82.72±3.65) g鱼相对于(413.83±39.92) g鱼更易受肉碱的影响而使其功能降低，影响肉碱的代谢，消除速度较(413.83±39.92) g鱼慢。

本试验中，以12 mg/kg剂量给罗非鱼口服肉碱，消除半衰期为8.73 h，而以120 mg/kg剂量时，消除半衰期为9.71 h；120 mg/kg剂量组的消除半衰期小于12 mg/kg剂量组，这与甲基睾丸酮在罗非鱼体内的药代动力学研究结果[16]类似。推测肉碱的剂量影响其在罗非鱼体内的药代动力学参数。

3.2 消除曲线多峰现象的探讨

研究药物动力学参数是选择药物种类、剂量以及用药周期重要依据，对确保人类的健康和水产养殖业的可持续发展具有重要意义。我国水产动物药理学研究发展空间和应用前景较大。

[1] 黄凯,陈涛,战歌,等.L-肉碱对奥尼罗非鱼生长、脂肪含量及血浆相关生化指标的影响[J].上海海洋大学学报,2010,19(2):201-206.

[2] Mendes G D, Zaffalon G T, Silveira A S, et al. Assessment of pharmacokinetic interaction between piracetam and l-carnitine in healthy subjects[J]. Biomed Chromatogr,2016,30(4):536-542.

[3] Dabrowska M, Starek M. Analytical approaches to determination of carnitine in biological materials, foods and dietary supplements[J]. Food Chemistry, 2013,142(3):220-232.

[4] Reuter S E, Evans A M. Carnitine and acylcarnitines pharmacokinetic, pharmacological and clinical aspects[J]. Clinical Pharmacokinetics,2012,51(9):553-572.

[5] 刘惠兰,张晓洁,曹峰.血液透析患者静脉应用左旋肉碱(可益能)的药代动力学研究[J].中国血液净化,2003,2(6):298-310.

[6] 徐少辉,武书庚,张海军,等.饲粮中添加L-肉碱对产蛋鸡生产性能、蛋品质及脂质代谢的影响[J]. 动物营养学报,2011,23(4):640-646.

[7] 柘丽曾,秋凤,丁雪梅,等.饲粮添加乳化剂与L-肉碱对肉鸡生长性能和血脂指标的影响[J]. 动物营养学报,2012,24(9):1754-1763.

[8] 徐少辉,张亚男,武书庚,等. L-肉碱对饲粮中添加葵花油的产蛋鸡抗氧化功能及鸡蛋品质的影响[J]. 动物营养学报，2011，23(7):1201-1208.

[9] 梁俊平,李健,张喆,等.肌注和口服恩诺沙星在大菱鲆体内的药代动力学比较[J].水生生物学报,2010,4(6):1122-1129.

[10] 宋洁,王贤玉,王伟利, 等. 硫酸新霉素在吉富罗非鱼体内的药代动力学及休药期[J]. 中国水产科学,2010,17(3):1358-1363.

[11] 洪二利,郑光明,孟娣,等. 甲基睾丸酮在罗非鱼体内的药代动力学[J].安徽农业大学学报,2011,38(6):911-915.

[12] 艾晓辉,陈正望. 磺胺二甲嘧啶在银鲫体内的药动学及组织残留研究[J]. 淡水渔业,2001,31(6):52-54.

[13] 陈文银,印春华. 诺氟沙星在中华鳖体内的药代动力学研究[J].水产学报,1997,27(3):434-437.

[14] 艾晓辉,陈正望,张春光,等. 喹乙醇在鲤体内的药物代谢动力学及组织浓度[J]. 水生生物学报,2003,27(3):273-277.

[15] 徐洪实,沈兰贞,梅长林,等. 尿毒症血透病人静脉应用左旋卡尼汀的药代动力学[J]. 中国药理学通报,1999,15(2):467-469.

[16] 洪二利,郑光明,孟娣,等.甲基睾丸酮在罗非鱼体内的药代动力学[J]. 安徽农业大学学报,2011,38(6):911-915.