新型二维液相色谱法测定人血浆中阿立哌唑的浓度

刘宇，李林，王锋

（1.云南省第一人民医院，昆明市650032；2.湖南德米特仪器有限公司，长沙市410011；3.中南大学湘雅二医院，长沙市410011）

精神分裂症是一组慢性致残性严重危害人类健康的精神疾病，大多数患者需要长期药物治疗，且是缓解患者症状与预防复发的最主要治疗手段。阿立哌唑（Aripiprazole，APP）[1]是二氢喹啉酮类抗精神病药，它在化学结构式和药理作用机制上均不同于其1、2 代抗精神病药，是首个5-HT/多巴胺系统稳定剂，不仅可以治疗精神分裂症的各种症状及改善认知功能，并且较少引起锥体外系症状、糖脂代谢障碍等不良反应，在维持治疗中具有依从性好、生活满意度提高、改善社会功能等优势，目前已成为治疗精神分裂症的一线药物。美国FDA于 2002 年 11月 15日正式批准用于治疗精神分裂症。2003年欧洲医药评估组织获准该药用于临床。2004 年底国内开始正式使用[2]。体外研究[3]表明，APP主要通过细胞色素CYP2D6和CYP3A4代谢，该酶的多态性可能是导致药物个体差异的主要原因，因此有必要检测其血药浓度，为个体化给药提供依据。

目前文献报道测定体内APP浓度的方法较多，有高效液相色谱法( HPLC) 、高效液相串联质谱法(HPLC-MS/MS) 和高效液相串联电喷雾离子化质谱法（HPLC-MS /ESI）。若采用常规液相色谱，极易堵塞色谱柱，因此对血样纯化的要求较高，而血样在处理过程中由于涉及复杂的固液转移或液液转移等多步操作，对实验操作者要求较高，使得操作过程难以控制，不利于临床样品监测。本文采用2D-LC-UV，它的优势在于对血样进行富集、转移和分离，剔除了大量杂质，提高了分离能力，减少了其他干扰，达到快速分离的目的。对于测定人血浆中APP的浓度简便、快速、可行，适合用于临床血药浓度的常规监测。

1 材料

1.1 仪器

仪器 2D-LC-UV 系统为 ANAX-岛津公司FLC2801 全自动二维液相色谱系统，第一维色谱系统(LC1) 为 ANAX 公司 FLC-2801( ANAX，湖南德米特仪器有限公司)，第二维色谱系统( LC2) 为岛津LC-20A 液相色谱(岛津公司，日本)构成，包括2个LC-20ATvp高压输液泵，LC-20ATvp 四元低压色谱泵，SIL-20AC自动进样器，SPD- 20Avp 检测器。第一维色谱柱主要负责样品预分离，第二维色谱柱主要负责样品的分离监测，中间接口以中间柱为“桥梁”采用“同向中心切割”的柱柱转换模式。GH-202 电子分析天平( AND 公司，日本) ，HS145型离心机（长沙安莱科分析仪器有限公司），XW-80A旋涡混合器（上海琪特分析仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

APP对照品（中国药品生物制品检定所，批号：100657-200401，纯度＞ 99%）；甲醇、乙腈（色谱纯，美国ACS公司），磷酸铵、（分析纯，南京化学试剂有限公司）；马血清（北京政博伟业生物科技有限公司，批号：160128）

2 方法与结果

2.1 溶液的配制

2.1.1 对照品溶液配制

精密称取APP对照品1.0mg于10mL容量瓶中，用适量50%异丙醇溶解后再加50%异丙醇定容至刻度，混匀，即得浓度为100μg·mL-1的APP标准溶液。放置于冰箱 4℃避光保存，使用时用50%异丙醇稀释至所需浓度。

2.1.2 质控样品的配制

精密吸取适量不同浓度APP对照品溶液，分别加入10mL容量瓶，用50%异丙醇定容至刻度，混匀，配制成220.6、441.2、882.3ng·mL-1的低、中、高三个浓度的质控样品。

2.2 血样处理

精密量取0.4mL血浆于EP管中，加入乙腈1mL，涡旋震荡1min，14500r/min离心8min，取上清1mL加入1.5mL进样瓶中，摇匀，进样300μL。

2.3 定量方法

采用外标工作曲线法定量，将APP样品峰面积代入标准曲线，计算所得浓度。每批随行测定高、中、低质控样品。

2.4 色谱条件

LC1系统中一维液相色谱柱为AstonSX1（4.6 mm× 25 mm，5μm），流动相为乙腈：甲醇：20mmol/L磷酸铵=20:10:18（V/V/V），用磷酸调PH至6.5，中间色谱柱AstonSCB（4.6 mm×10 mm，5 μm），LC2系统中二维色谱柱为AstonSCB（4.6 mm×50 mm，5μm），流动相为碱：酸：甲醇：乙腈=8:29:15：48（V/V/V/V）。柱温40℃，检测波长252nm，流速1.2ml/min，进样体积300μL。FLC2420系统是通过3个工序流程进行目标组分APP的二维分离，其中工序1是样品通过自动进样器进样，在一维色谱柱进行初步分离，工序2为样品中目标组分APP转移至中间柱中，工序3是中间柱中的目标组分在二维流动相淋洗下进一步分离，被后端UV检测器检测。见图1。其系统运行程序见表1。

2.5 色谱行为和方法专属性

在“2.4”项下色谱条件，APP色谱峰的总体运行时间为8.50min，保留时间为5.3min左右，其中第一维

图1 FLC 2420二维液相色谱分离检测工序

工序与捕获工序占有1.83min，而第二维分离时间却可达到5.7min，这就是由于2D-LC-UV系统有别于其他HPLC的优势，可以同时进行在线分离和进样，减少了中间环节，且色谱峰在此时间段内无干扰峰及其他干扰。见图2。

表1 FLC2420二维液相色谱系统运行时间程序

图2 阿立哌唑2D-LC-UV色谱图

A 空白血浆（blank plasma）

B对照品溶液（reference 551.5ng·mL-1）

C对照品+空白血浆（blank plasma spiked with reference ，441.2 ng·mL-1）

D 血样（blood sample，491.3 ng·mL-1）

2.6 标准曲线与线性范围

使用标准储备液，配成浓度分别为68.9、137.9、275.7、551.5、1102.9ng·mL-1的APP标准含药血浆，按“2.2”项下方法操作处理、“2.4”项下色谱条件进样。以浓度为自变量（X），峰面积为因变量（Y）作回归计算，APP在68.9～1102.9ng·mL-1呈良好线性关系，回归方程为：

2.8 绝对回收率

精密量取220.6、441.2、882.3ng·mL-1的低、中、高三个浓度的APP质控样品，按“2.2”项下方法操作处理、“2.4”项下色谱条件进样。与对应浓度的APP对照品工作液峰面积进行比较，平行3组。结果低、中、高3个浓度处理样品的绝对回收率为96.1%、98.2%、94.8%。表明绝对回收率高且稳定。

2.9 精密度与准确性

精密量取220.6、441.2、882.3ng·mL-1的低、中、高三个浓度的APP质控样品，按“2.2”项下方法操作处理、“2.4”项下色谱条件进样。1天测定5次，连续测定5天，计算APP的日内、日间精密度和准确性，结果见表2。

2.10 稳定性考察

表2 日内、日间精密度与准确度

取低、中、高3个浓度的APP质控样品，分别在室温条件下放置 0 、2、4、8、12小时，反复冻融2次，-20 ℃冰箱中保存 0、5、10、20、30天后，按“2.2”项下方法操作处理、“2.4”项下色谱条件进样。结果各浓度水平测定值的 RSD 值均小于7.9 %。表明，在此实验条件下血浆中的APP稳定性良好。

3 讨论

临床实际应用中，某些药物治疗指数低、安全范围窄、服药周期长、体内过程和疗效存在较大个体差异，特别是与其他药物联用，药物间由于存在相互作用从而导致体内血药浓度与单用比差异较大，进而影响临床疗效，医师仅凭自身经验用药往往难以控制病情，为此有必要对这些药物用药后的血药浓度进行监测，尤其是对需要长期进行药物治疗以缓解症状与预防复发的精神类药物。阿立哌唑主要用于精神分裂症患者，但资料显示[3]阿立哌唑血药浓度差异性较大，呈非正态分布，这可能与药物代谢的个体差异有关，为此对其体内浓度进行监测很有必要，以便及时调整给药剂量，保证临床用药安全、合理、有效。

目前血样前处理、进样体积小、干扰物质多、灵敏度低及出峰时间长一直是困扰体内药物浓度监测的难点，也是误差引入和耗时过长的主要原因。新型二维液相色谱结合紫外线检测系统（2D-LC-UV）的引入从不同层面解决了这一问题。2D-LC-UV不同于已有文献报道[3-4]，共使用了3根色谱柱，一维色谱柱即萃取柱负责血样的在线富集及初步分离，中间色谱柱负责对血样进行捕获及运送，二维色谱柱即分析柱负责血样的进一步分离。它的优势在于对血样进行富集、转移和分离，剔除了大量杂质，提高了分离能力，减少了其他干扰，达到快速分离。

一般而言，样品在进样前均需采用有机溶剂或酸、碱等进行处理，且进样量体积小，为10～20μL[4]。而本法采用乙腈沉淀蛋白后直接进样，进样量达到300 μL，比普通的检测分析方法快速且进样量高出10～20倍，采用大体积进样，提高了绝对进样量，检测灵敏度完全满足临床需要，因此大大减小了进样偏差，即使采用外标法也可以获得良好准确性及精密度。辅助聚焦体系通过在特定时间改变流动相的比例使得药物呈点状进入色谱柱，消除大体积进样时药物分散引起的扩散误差。是因为本系统中具备在线聚焦体系和在线过滤机清洗装置，能克服目标物传递的非正态性扩散和色谱柱易堵塞的问题，保证色谱峰形对称以及提高抗堵塞能力，弥补了液液萃取易乳化、易污染和回收率不高的缺陷，从而具备高灵敏度以及良好的可定量性和耐受性[5]。因此对分析人体血浆及其他复杂生物样本具有强大的去干扰能力。

另外，本试验方法与以往的二维液相色谱的另一不同之处在于使用了中间柱作为桥梁来连接一维色谱柱和二维色谱柱，实现了目标物有效转移的同时也减小了两根长柱直接连接压力过高造成的色谱柱和仪器损伤，且中间柱的加入能够减小二维色谱法流动相兼容问题[5]。

在本试验色谱条件下，一个样本从前处理、色谱分离到待测目标物检测分析仅需20-30min，具有分析速度快、自动化程度高、重复性与精密度以及准确度好的优点，实现了对阿立哌唑的在线分离及分析检测。

【参考文献】

[1]许秀峰,司天梅,李涛,等. 阿立哌唑临床应用专家建议( 二) [J].临床精神医学杂志,2015 25(1): 1-3.

[2]朱紫青, 张明园. 第3代抗精神病药阿立哌唑研究进展[J].中国医院用药评价与分析. 2005, 5(2): 121-123.

[3]吴逢春,佘生林,谭就维,等. 阿立哌唑治疗急性期精神分裂症的血药浓度与剂量及疗效的相关性[J]. 广东医学,2013,34(12):1908-1910.

[4]彭向东,周淦,谭志荣. 双氯芬酸钠缓释片在健康人体的药代动力学和生物等效性[J]. 中国新药杂志,2011,20(20): 2005-2009.

[5]邓阳,颜苗,王峰. 基于2D-HPLC结合捕集柱技术测定人血中双氯芬酸钠浓度及其应用[J]. 中国药学杂志, 2015,50 (24): 2146-2150