流式细胞仪在生乳质量管控中的应用和认可

王晓雨

Application and Recognition of Flow Cytometry in Control of Raw Milk Quality

摘要：从1998年12月美国安大略的奶牛农户开始使用细菌快速分析仪来检测其生乳的细菌含量水平，通过对生乳细菌检测中这种技术的引进以及这种技术上的转变对细菌计数结果的影响。如果养殖人员发现细菌总数升高，他们应该怎么办，如何解释细菌数升高的机理。同时也简述了细菌快速分析技术在美国获得NCIMS（National Conference on Interstate Milk Shipments）/FDA认可的情况。

Abstract： From December 1998 Dairy farmers in Ontario， USA， began using a bacterial rapid analyzer to detect the level of bacterial content in their milk， through the introduction of this technique in the detection of raw milk bacteria and the effect of this technological shift on the results of bacterial counts. If the farmers find that the total number of bacteria is rising， what they should do and how to explain the mechanism of the increase in bacteria. It also briefly describes the conference of bacterial Rapid Analysis technology in the United States obtained ncims （National on Interstate Milk shipments）/FDA recognition.

關键词：细菌总数；快速分析；生乳；质量管控；认可

Key words： total number of bacteria；rapid analysis；raw milk；quality control；recognition

中图分类号：TS252.7 文献标识码：A 文章编号：1006-4311（2018）15-0260-02

1 流式细胞仪（全自动细菌计数仪）的使用情况

近几年，一般而言，伴随着使用细菌快速测定仪来检测细菌水平技术的转变，细菌计数结果呈现上升的趋势，这是引进这一新技术后所带来的直接的后果。

众所周知，牛奶中的一些细菌通常聚集在一起，以集合体的形式存在。以前在使用平板测试SPC（Standard Plate Count）方法时，不管细菌的单细胞，还是这种集合体都将视为一个单位。但是细菌快速测定仪来检测牛奶的细菌水平以每个活的细菌个体为单元，测试结果更加准确。

检测仪器计数结果可以转换为SPC的测试结果，养殖人员通常提供两种结果，仪器计数用作结果信息，而奶农组织即DFO（Dairy Farmers of Ontario）的处罚项目则依赖于SPC结果。即使SPC测试显示可接受的结果，但养殖户也非常关注仪器的计数结果，因为在将来，DFO将以细菌计数仪的结果作为其处罚依据。如果其结果很高，奶户的第一个疑问就是：细菌的来源是什么。

当开展奶户调查时，DFO的代表关注四个方面：牛奶接触面，乳房接触面，冷却效率和日常管理。其中对前三方面合理的维护对低的细菌和体细胞数是非常重要的。通常情况下，养殖人员应当自己评价上述性能指标，以查明细菌的来源。

在调查中，DFO代表认为，如果没有乳房感染的情况下，新挤出的牛奶本质上应该处于细菌贫瘠状态。乳房感染的牛奶的细菌数会升高。感染有临床和亚临床两种，有两种起因：一种是来自诸如草垫，饲料和肥料等有机物质的环境污染，另一种则是在从一个挤奶器到另一个转移时的污染。对此，他们对奶户提出了以下几点改进建议：

①减少乳房与一些有机物质的接触是最好的预防措施。及时发现感染致病菌的病牛防止其传染其它牛个体也非常关键。养殖人员应当与兽医密切合作，及时采纳兽医的建议来处理，隔离和精选。

②从干净，干燥的乳头挤奶也非常重要。一些细菌在肥料、草垫、泥土或土壤能够很好的生长。在挤奶的过程中，如果奶头不干净，不干燥，这些细菌与乳房接触就会进入牛奶中。一旦进入牛奶中，这些细菌在低温下也会生长。

③适当的清洗和卫生学处理挤奶器将有助于减少细菌污染。通常有一些区域难于清洗，比如弯曲部分、接合处、盲端和橡胶成分。而破损的、裂缝的橡胶成分可以堆积乳固体，这些成为细菌生长的良好的培养基。养殖人员应当选择5个检测点的4个，比如接奶器，通气口，储奶罐和搅拌子定期检查，清洗和替换。

④有效的冷却是最后一个关键因素。如果不能快速冷却，大的储罐中因为任何原因引入的细菌就会快速繁殖。

保持低的细菌数目是一个总体质量管理项目。整个监控过程开始于奶牛个体，结束于大的储罐的出口管。必须切记，一个或多个污染源都会导致一个高的细菌水平。

SPC的测定值和细菌快速测定法测定数值不一致，主要原因在于牛奶中一些细菌的集合体，每个集合体包括2到10个细菌单细胞。特定的培养时间、温度以及其它因素都会影响特定类型的细菌的生长，而其中的一些细菌在使用标准平板测试方法时则不繁殖。

有三类主要细菌类群，如嗜冷菌、嗜温菌和嗜热菌。不同条件下不同的细菌类型繁殖生长。嗜冷菌在低温下生长，但在高温时也可生长很好。嗜温菌在25到40℃时可以很好生长，嗜热菌在45到60℃时可以很好生长。

使用以前的SPC测试方法，样品要在35℃的平板上培养48小时。因为嗜温菌在25到40℃时可以很好生长，这些细菌类型使用这种方法就可准确检测。

细菌快速分析仪可以准确检测所有的细菌类型。首先通过机械和化学试剂处理将细菌和其它牛奶中的颗粒物质如蛋白，脂肪和体细胞破坏，而后染色后的细菌个体依次通过流式细胞计数仪，这样就可检测每个单个的细菌细胞而不是细菌的集合体。所以它可在检测嗜冷菌和嗜热菌上标准方法的方法要准确得多。

如果细菌测定仪结果显示样品细菌数目升高，通常需要采取下述三个步骤：

①评价挤奶管理操作，特别是挤奶前的乳头清洗。要从干净，干的乳头挤奶。嗜冷菌要给予特别关注，一些嗜冷菌在肥料，草垫，泥土或土壤能够很好的生长。在挤奶的过程中，如果奶头不干净，不干燥，这些细菌与乳房接触就会进入牛奶中。一旦进入牛奶中，这些细菌在低温下也会生长。

②开展牛奶接触面的常规检查，比如接奶器，通气口，储奶罐和搅拌子定期检查，清洗和替换。

③确认储奶罐得到有效冷却。在第二个以及后续的挤奶器中混合后的温度不应超过10℃。最终的牛奶应该在2小时内冷却到1到4℃之间。

2 细菌快速测定技术赢得NCIMS/FDA认可

如今，经过美国的NCIMS（National Conference on Interstate Milk Shipments）的认可，细菌快速分析技术已成为一种新的细菌计数方法，被广泛用于牛奶的按质论价项目和卫生学质量的检测方面。在过去的两年里，按照FDA的实验室质量保证的草案，细菌快速分析仪在美国被广泛使用在牛奶测试上。最终的目标在于收集数据使细菌快速测定方法得到FDA的认可，从而作为在原料奶测试中使用的平板培养法，细菌总数测试片法和平板Loop计数法的替换方法。

在得到NCIMS的认可后，细菌快速分析技术正逐渐成为美国在原料奶的测试中的标准方法。这种认可意味着细菌快速分析技术成为全世界范围内的牛奶按质论价的推荐方法。

3 牛奶质量的按质论价测试

细菌快速测定仪在原料奶管理和按质论价上已在世界范围内使用多年，如今，包括澳大利亚，新西兰，英国，德国，意大利，法国，波兰，日本，爱尔兰，荷兰，西班牙，奥地利，加拿大，韩国和丹麦等35个国家的400多个单位都在使用。欧盟多于90%的牛奶借助于这个技术的发展已经实现按质论价。

细菌快速测定仪通过自动计算牛奶中单个细菌细胞的总数来确定原料奶的卫生学质量。基于独特的技术，仅有细菌被计数。在过去的25年里，这种流式细胞技术屡屡得到发展和修订，现在已被完全建立，在世界范围内作为计数牛奶中细菌的方法。这种技术在10分钟内出结果，不像其它方法需要48-72小时。在NCIMS/FDA认可的规则下，流式细胞技术在美国已使用好几年，用于原料奶中的体细胞计数。

自2014年宁夏夏进乳业集团公司引进了Foss公司的细菌快速测定即BactoScan FC设备，用于快速分析生乳中的细菌总数含量即自动化的细菌计数方法，它每小时最多可测定150个样品而且及时输出结果，它完全取代了耗时几天的传统方法。为牧场、园区现场管理提供技术支持。该仪器使用简单的试剂理念降低了每个样品的试剂使用费用。在测定正确率，精度和准确度上具有很高的性能。在检测和控制生乳方面實现了操作自动化和高效率。因为检测结果快速、及时，所以可用于故障的在线检测，在诊断和修正牧场出现的管理或是养殖方面的问题比其它方法更快。总之，使用细菌快速测定仪，在快速检测，发现异常和制定解决方案上，牧场主，乳制品加工企业和消费者都将获益。

参考文献：

[1]JacQueG.Black（ed.） Microbiological Principles&Applications; 3rd edition，New Jersey. Prentice Hall，1996.

[2]郭本恒主编.乳品微生物学[M].中国经工业出版社，2003.

[3]内蒙古轻工科学研究所.乳品工艺，内蒙古轻工业学校，1998.

[4]郑晓冬主编.食品微生物学[M].杭州：浙江大学出版社，2000.

[5]金世琳主编.乳品微生物学[M].呼和浩特：内蒙古大学出版社，1993.