C/EBPβ在氧化低密度脂蛋白诱导的白介素1β成熟过程中的作用

马骏，余三九，康华丽，邓梦杨，黄岚

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是由脂质代谢紊乱引起的慢性炎症性疾病，是引起心脑血管疾病的主要病因[1-2]。巨噬细胞在AS的形成过程中起着至关重要的作用。巨噬细胞吞噬脂质，分泌大量炎性分子促进AS的发生发展，同时巨噬细胞发生凋亡可导致斑块破裂引发心脑血管事件[3-5]。氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)浓度升高是AS发生的关键性因素[6]。在ox-LDL诱导巨噬细胞形成泡沫细胞的过程中会引发细胞产生一系列炎症反应[6-7]。炎症反应是AS发生发展的另一重要因素[1]，白介素1β(IL-1β)即为关键性的促炎因子之一。在IL-1β的生成过程中，前体蛋白(pro-IL-1β)经过剪切形成成熟体蛋白(cleaved-IL-1β)，最后分泌至胞外影响动脉粥样硬化的发生发展[8]。研究表明，IL-1β单抗治疗AS引起的冠心病能明显降低不良心血管事件发生率[9]。因此，IL-1β是治疗动脉粥样硬化性心血管疾病的重要靶点，探索相关机制对于治疗AS十分关键。近期有文献报道CCAAT/增强子结合蛋白β(C/EBPβ)能显著影响动脉粥样硬化的发生，例如，与普通ApoE-/-小鼠相比，C/EBPβ敲除的ApoE-/-小鼠主动脉斑块发生率明显降低[10]。C/EBPβ在炎症调控方面有着重要作用[11]，有文献报道其可增加IL-1β前体蛋白的表达[12]，然而C/EBPβ是否可以调控IL-1β前体的成熟并不清楚。半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(caspase-1)是调控IL-1β成熟的关键性蛋白[12]，C/EBPβ是否与caspase-1存在相互作用，值得探究。本研究观察了C/EBPβ对IL-1β成熟及分泌的影响，并探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株及主要试剂 小鼠巨噬细胞株RAW264.7从ATCC细胞库购买。RPMI 1640细胞培养基及Opti-MEM购自美国HyClone公司，胎牛血清及胰酶购自美国Gibico公司，C/EBPβ、IL-1β前体蛋白、IL-1成熟体蛋白、caspase-1及GAPDH单克隆兔抗小鼠抗体购自美国Abcam公司，RNA提取、反转录试剂盒及PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司，ox-LDL购自中国广州奕源生物公司，ELISA Quantikinekits试剂盒购自美国R＆D Systems公司，青霉素、链霉素以及Western blotting试剂盒购自中国碧云天公司，Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司。

1.2 细胞处理及分组 RAW264.7在含有7%胎牛血清、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的RPMI 1640的培养液中，于37℃、5%CO2培养箱中培养。分别用0、25、50、100μg/ml ox-LDL处理细胞12、24、48h，以不同时间点的0μg/ml ox-LDL为对照组，利用PCR及Western blotting检测C/EBPβ基因及蛋白的表达变化。观察到50μg/ml ox-LDL处理24h时C/EBPβ蛋白表达开始出现明显上升，选择该条件作为后续实验的处理条件。采用50μg/ml ox-LDL处理细胞24h，以0μg/ml ox-LDL为空白对照组，Western blotting观察ox-LDL对caspase-1、IL-1β前体、IL-1β成熟体蛋白表达的影响。随后利用小干扰RNA对C/EBPβ及caspase-1的表达进行敲减，共分为4组，即未做处理的对照组，仅用ox-LDL处理的阴性对照组(对照+ox-LDL组)，敲减C/EBPβ并用ox-LDL处理的si-C/EBPβ+ox-LDL组，敲减caspase-1并用ox-LDL处理的si-caspase-1+ox-LDL组，观察C/EBPβ、caspase-1、IL-1β前体、IL-1β成熟体蛋白的表达情况，并采用ELISA法检测IL-1β的分泌情况。

1.3 小干扰RNA转染敲减C/EBPβ及caspase-1的表达 C/EBPβ siRNA和caspase-1 siRNA均获自上海吉玛公司，序列如下：C/EBPβ，正义链5'-CCAUGGAAGUGGCCAACUUTT-3'，反义链5'-AAGUUGGCCACUUCCAUGGTT3'；caspase-1 RNA，正义5'-GCUGAAACAUUUGUUGCUATT-3'，反义5'-UAGCAACAAAUGUUUCAGCTT-3'。将RAW264.7细胞在6孔板(2×106个细胞/孔)中培养12h，随后将siRNA转入细胞。转染后，将细胞再温育12h，将培养基换成含有7%血清的RPMI 1640继续培养24h。

1.4 实时定量荧光PCR检测C/EBPβ基因的表达使用RNAiso试剂从处理的RAW264.7细胞中分离RNA。根据TaKaRa反转录试剂盒使用说明书将分离的RNA反转录为cDNA，并进行PCR。引物由上海生工合成，以GAPDH mRNA表达水平作为内参照。

1.5 Western blotting检测相关蛋白的表达 将处理完毕的细胞取出400μl含PMSF(终浓度1mmol/L)的RIPA裂解液(碧云天)，冰上充分匀浆后，4℃、10 000r/min离心15min，并收集上清，采用BCA法进行蛋白定量，之后上样：每泳道50μg蛋白样品，SDS-PAGE恒压电泳(5%浓缩胶阶段设置电压为80V，时间60min；10%分离胶阶段电压为120V，时间1h)直至蛋白分离，然后切胶，转膜。5%脱脂奶粉室温封闭2h，加入C/EBPβ鼠单克隆抗体(1:1000)及GAPDH(1:5000)4℃过夜。次日，TBST洗膜3次(10min/次)。加入二抗(1:10 000，碧云天)，37℃孵育1h；TBST洗膜3次，进行曝光。以GAPDH为内参照。

1.6 ELISA检测细胞上清液中IL-1β水平 以C/EBPβ蛋白表达明显上升时的条件(50μg/ml ox-LDL处理24h)对细胞进行处理，观察细胞上清液中IL-1β的水平。RAW264.7细胞接种于6孔板中，采用小干扰RNA对细胞进行转染，ox-LDL 50μg/ml处理24h后，提取细胞上清液，按照试剂盒说明书使用ELISA Quantikine kits检测上清液中的IL-1β水平以评估细胞IL-1β分泌情况的变化。

1.7 统计学处理 采用SPSS 13.0软件进行统计分析。数据结果均以±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 ox-LDL对C/EBPβ mRNA表达的影响 与空白对照组(1.3700±0.1565)相比，细胞处理12h后，50μg/ml ox-LDL组C/EBPβ mRNA表达水平(2.8510±0.2124)明显升高(P＜0.05)，而100μg/ml ox-LDL组C/EBPβ mRNA表达进一步升高(P＜0.05)；当细胞处理24h及48h后，25μg/ml ox-LDL组C/EBPβ mRNA表达水平明显升高(P＜0.05)，均呈浓度依赖性增加(图1)。

2.2 ox-LDL对C/EBPβ蛋白表达的影响 Western blotting检测结果显示，与空白对照组相比，ox-LDL刺激巨噬细胞株12h未引起C/EBPβ蛋白水平的明显变化，而处理24h后，与对照组(0.2440±0.0219)相比，50μg/ml ox-LDL组C/EBPβ的蛋白表达(0.3839±0.0106)明显升高，而100μg/ml ox-LDL组增加更为明显(P＜0.05)；ox-LDL处理巨噬细胞株48h后，25μg/ml ox-LDL组C/EBPβ蛋白表达明显升高(P＜0.05)，同样呈浓度依赖性(图2)。

图1 不同浓度ox-LDL处理巨噬细胞不同时间后C/EBPβ mRNA表达的变化(n=3)Fig.1 C/EBPβ mRNA expression in macrophages treated with different concentrations of ox-LDL for different time (n=3)

图2 不同浓度ox-LDL处理巨噬细胞不同时间后C/EBPβ蛋白表达的变化(n=3，Western blotting)Fig.2 C/EBPβ protein expression in macrophages treated with different concentrations of ox-LDL for different time (n=3, Western blotting)

2.3 ox-LDL对caspase-1、IL-1β前体及IL-1β成熟体蛋白表达的影响 Western blotting检测结果显示，50μg/ml ox-LDL刺激细胞24h后，caspase-1、IL-1β前体和成熟体蛋白表达水平均明显升高(P＜0.05，图3)。

2.4 C/EBPβ或caspase-1敲减后caspase-1、C/EBPβ表达及IL-1β生成的影响 与对照组相比，ox-LDL能明显增加C/EBPβ、caspase-1、IL-1β前体及成熟体蛋白的表达以及IL-1β的分泌(P＜0.05，图4)。敲减C/EBPβ之后，ox-LDL诱导的caspase-1、IL-1β前体及成熟体蛋白表达以及IL-1β分泌均被明显抑制，与对照+ox-LDL组相比分别为0.5302±0.0253 vs.0.8121±0.049、0.6178±0.0500 vs. 0.9788±0.0959、0.2511±0.0298 vs. 0.5485±0.0664及7.626±0.665pg/ml vs. 16.25±1.223pg/ml(P＜0.05，图4)。而敲减caspase-1之后，仅ox-LDL诱导的IL-1β成熟体表达及IL-1β分泌被抑制，对C/EBPβ及IL-1β前体蛋白的表达无明显影响(P＜0.05，图4)。

图3 50μg/ml ox-LDL处理细胞24h后caspase-1、IL-1β前体、IL-1β成熟体的表达变化(n=3，Western blotting)Fig.3 Expressions of caspase-1, pro-IL-1β and cleaved-IL-1β in cells treated with 50μg/ml ox-LDL for 24h (n=3, Western blotting)

图4 C/EBPβ及caspase-1敲减后C/EBPβ、caspase-1、IL-1β前体、IL-1β成熟体的表达及IL-1β分泌的变化(n=3)Fig.4 Expressions of C/EBPβas well as C/EBPβ, caspase-1, pro-IL-1β and cleaved-IL-1β after caspase-1 knocked down and the IL-1β secretion (n=3)

3 讨 论

本研究主要观察在ox-LDL诱导巨噬细胞释放IL-1β的过程中，C/EBPβ是否可以调控IL-1β的产生，以及如何进行调控的。结果显示，ox-LDL可以浓度依赖性地刺激C/EBPβ表达上升，同时，敲减C/EBPβ表达后，可以引起IL-1β前体、成熟体，以及促进IL-1β成熟的关键蛋白caspase-1表达的降低，最终导致IL-1β分泌减少，而敲减caspase-1并不能引起C/EBPβ表达的下降。本研究结果提示，ox-LDL能够浓度依赖性增加巨噬细胞内C/EBPβ的表达，与先前的动物实验结果一致[10]。然而，ox-LDL是如何增加C/EBPβ的表达并不清楚。有文献报道Toll样受体4(TLR4)可以直接调控C/EBPβ[13]，在ox-LDL刺激巨噬细胞后，TLR4表达升高[14]，因此，我们推测ox-LDL可能通过增加TLR4的表达来影响C/EBPβ的表达，但其中的具体机制还有待进一步研究。此外，本研究结果还显示ox-LDL可增加IL-1β前体的表达及成熟，增加促IL-1β成熟的关键性蛋白caspase-1的表达，并最终增加IL-1β的分泌，这与先前的文献报道一致[8]。在C/EBPβ表达降低之后，ox-LDL诱导的IL-1β前体、成熟体和caspase-1表达以及IL-1β分泌均明显下降，而敲减caspase-1之后，仅IL-1β成熟体的表达以及IL-1β分泌下降，表明C/EBPβ不仅可以调控IL-1β前体的表达，还可调控caspase-1促IL-1β前体成熟的过程，并最终通过这两方面来影响IL-1β的分泌。然而，C/EBPβ是如何调控caspase-1的目前尚无文献报道。NLRP3炎性小体是caspase-1关键性的上游分子蛋白，且在脂质体刺激下表达同样升高[15-16]，因此推测C/EBPβ调控caspase-1很可能与NLRP3有关系，然而进一步的机制有待验证。

综上所述，本研究证实，ox-LDL刺激巨噬细胞后，细胞内C/EBPβ表达明显上升，并进一步引起促炎因子IL-1β的产生。C/EBPβ促进IL-1β产生的机制，一是直接增加IL-1β的表达[12]，二是通过调控caspase-1增加IL-1β前体向成熟体的转化。C/EBPβ是调控IL-1β的一个关键性蛋白，有望成为动脉粥样硬化抗炎治疗的新靶点。然而，ox-LDL是如何刺激C/EBPβ，以及C/EBPβ是如何调控caspase-1表达的，仍有待进一步研究证实。

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