创伤弧菌溶细胞素对小鼠骨髓来源巨噬细胞坏死性凋亡的作用及机制

帅维正，刘剑飞，吴成林，刘妍，蒲倩，王欲晓，周丽君，张志成，段蕴铀

创伤弧菌(Vibrio vulnificus)是我国沿海常见的致病性海洋弧菌，通常以经消化道感染多见，但也可通过伤口沾染后致病，如海上作业和训练时破损的皮肤黏膜接触含菌海水即可发生严重感染[1-2]。创伤弧菌感染机体后除导致局部症状和损伤外，脓毒症是其造成的严重后果之一[3]，文献提示一旦发生创伤弧菌感染所致脓毒症，病死率可超过50%[4]。创伤弧菌的主要致病因子包括溶细胞素、金属蛋白酶、软骨素酶、透明质酸酶等细胞外产物[5]，其中针对创伤弧菌溶细胞素(Vibrio vulnificus cytolysin，VVc)的研究较多，VVc可对不同细胞产生致伤致死作用，导致细胞溶解、凋亡等。目前的研究多集中在VVc所致细胞凋亡的机制等方面，但凋亡作为非炎症性的细胞死亡方式，不能解释创伤弧菌引起的剧烈炎症反应，尤其是脓毒症休克。坏死性凋亡(necroptosis)是新近发现的一种可调节炎症性细胞坏死方式，其在具有程序性死亡特性的同时，还具有可以引起并扩大炎症反应的特点。近年来研究显示坏死性凋亡在许多人类疾病中起重要作用，而坏死性凋亡是否在创伤弧菌的致病过程中发挥作用，目前尚无报道。本研究探讨VVc在永生化小鼠骨髓来源的巨噬细胞(immortalized bone marrow-derived macrophage，iBMDM)坏死性凋亡中的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及材料 iBMDM由邵峰院士惠赠，DMEM培养液及磷酸盐缓冲液(PBS)购自美国Hyclone公司，胎牛血清(FBS)购买于美国Gibco公司，CytoTox 96®非放射性细胞毒性检测试剂盒购自美国Promega公司，Annexin V-FITC/PI试剂盒购自德国美天旎公司，caspase1、caspase11抗体购自圣克鲁斯生物技术有限公司，GSDMD(gasdermin D protein)、混合系列蛋白激酶样结构域(mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL)、磷酸化MLKL(pMLKL)抗体购自美国Abcam公司。受体相互作用蛋白1(receptor-interacting protein 1，RIP1)抑制剂necrostatin-1(Nec-1)购自美国Sigma公司。

1.2 VVc蛋白制备 使用本单位前期制备的VVc蛋白， 根据GenBank中公布的VVc(GenBank=NC_005140.1)序列设计扩增目的基因引物。Pvvf1：5'-GCGGATC CATGAAAAAAATGACTCTGTTT-3'(BamH Ⅰ)；Pvvr2：5'-CCCTCGAGGAGTTTGACTTGTTGTAAT GT-3'(Xho Ⅰ)，由上海生工进行基因的克隆与鉴定，并构建原核表达质粒，获得在大肠埃希菌中的高效表达并行SDSPAGE鉴定，将纯化VVc蛋白置于–70℃保存备用[6]。

1.3 乳酸脱氢酶(LDH)检测评价细胞毒性 按不同浓度梯度(1、2、4μg/ml)VVc刺激iBMDM，采用细胞毒性检测试剂盒测定细胞上清LDH水平。具体方法为：将50μl待测细胞上清转移至96孔酶分析板中，每孔均加入50μl底物，用铝箔纸覆盖，室温孵育30min；加入50μl终止液，检测490nm波长处吸光度(OD)值。死亡率(%)=(实验组OD值－阴性组OD值)/(阳性组OD值－阴性组OD值)×100%。

1.4 细胞培养及分组 根据上述结果将iBMDM分为5组：对照组、VVc 2μg/ml组、VVc 2μg/ml+Nec-1 5μmol/L组、VVc 4μg/ml组和VVc 4μg/ml+Nec-1 5μmol/L。用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基培养，加入青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)，置于5% CO2、37℃、恒温、恒湿的培养箱中进行培养。VVc组以相应浓度VVc刺激iBMDM细胞，RIP1抑制剂组在VVc处理前1h加入5μmol/L的Nec-1，2h后收集细胞和培养基上清。

1.5 流式细胞仪检测iBMDM凋亡情况 采用流式细胞检测试剂盒测定细胞状态。具体方法为：收集待测细胞，加入1ml结合缓冲液漂洗细胞，300×g离心10min，弃上清；加入100～150μl结合缓冲液重悬细胞，加入10μl annexin V，混匀避光室温孵育15min；再加入1ml结合缓冲液，300×g离心10min，弃上清；加入500μl结合缓冲液重悬；加入5μl PI，上机检测。

1.6 Western blotting检测焦亡与坏死性凋亡相关蛋白的表达 收集各实验孔细胞，提取蛋白，行12% SDS-PAGE凝胶电泳；采用湿转方法，将蛋白转印至0.2μm孔径的PVDF膜上：将转印好的PVDF膜在TBST配制的5%BSA中室温封闭3h，TBST洗膜3次，每次5min；加入一抗[MLKL(1:1000)，pMLKL(1:1000)，Actin(1:10 000)]4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次5min；加入TBST配制的5%BSA，再加入二抗(均为HRP标记山羊抗兔抗体1:10 000)室温水平摇床孵育1h，TBST洗膜3次，每次5min。采用化学发光剂ECL显色，GE化学发光成像系统进行图像采集，采用Image J软件对灰度值进行分析。

1.7 统计学处理 采用SPSS 13.0软件进行统计分析。计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，进一步两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 LDH法评价VVc对iBMDM细胞的毒性情况采用1、2、4μg/ml不同浓度VVc刺激iBMDM细胞2h，如图1所示，LDH水平随VVc浓度升高而上调，提示细胞死亡率增加，其中4μg/ml浓度处理后LDH明显上升，而2μg/ml浓度次之；加入Nec-1预处理后，细胞上清LDH水平明显降低(P＜0.05)。

2.2 流式细胞仪检测iBMDM凋亡情况 流式细胞仪检测结果显示，iBMDM接受VVc处理后，Annexin V/PI双染色阳性细胞比例增加，使用Nec-1预处理后，双阳性染色细胞的比例下降(P＜0.05，图2)。

图1 LDH法评价VVc处理对iBMDM细胞的毒性(n=3)Fig.1 Analysis of LDH levels in supernatant of iBMDM cells following the VVc challenge (n=3)

图2 流式细胞术检测iBMDM凋亡情况Fig.2 Effect of VVc on iBMDM cells (Flow cytometry)

2.3 Western blotting检测焦亡与坏死性凋亡相关蛋白的表达 Western blotting检测结果显示，iBMDM在接受VVc刺激后，存在磷酸化MLKL(pMLKL/MLKL)表达上调，而这一磷酸化过程可被Nec-1预处理所抑制(P＜0.05，图3A)。VVc刺激后，caspase1、caspase11以及GSDMD等凋亡相关蛋白表达量有所变化，但均未见其活化剪切体表达(图3B)。

3 讨 论

VVc是具有创伤弧菌种属特征性的外毒素，是创伤弧菌感染的重要致病因子[7]。研究表明，VVc通过诱导产生超氧阴离子，介导钙离子内流以及刺激合成一氧化氮合酶(NOS)等方式启动细胞凋亡信号通路的活化[8-10]。此外，也有报道提示VVc可通过诱导巨噬细胞TNF-α和IL-6表达，上调机体炎症反应水平[11]，但是否会导致炎症性细胞程序性死亡则未见明确报道。

坏死性凋亡和焦亡均属于程序性细胞死亡(programmed cell death，PCD)，目前认为GSDMD和MLKL是焦亡和坏死性凋亡的最终执行蛋白，当其转化为激活状态时标志着各自细胞程序性死亡的发生[12]。虽然同属PCD，但两者也有着明显的差异。首先，调控途径不同，在坏死性凋亡发生的过程中，MLKL由于受到坏死复合物(necrosome)关键组分中RIP1和RIP3的调控而出现磷酸化，进而发生寡聚化并转位于细胞膜上，激活相关离子通道。而在焦亡的进程中，炎症型半胱氨酸天冬酶caspase-1和caspase-11通过剪切GSDMD蛋白使其产生具有活性的氮段蛋白片段(GSDMD-NT)，GSDMD-NT形成聚合物后在细胞膜内面上的脂质双分子层形成小孔。其次，作用方式不同，虽然两者同样为细胞膜完整性受损，表现为细胞PI染色阳性。但磷酸化的MLKL在细胞膜上产生具有选择性的离子通道开放，而GSDMD-NT却形成的是非选择性的小孔[13]。本研究中，虽然细胞接受处理后死亡现象明显，焦亡相关蛋白原形形式(caspase-1、caspase-11、GSDMD)有表达量的变化，却均未见活性剪切体的出现，因此无法证明其中发生了焦亡，有待后续研究对其进行深入探讨。

图3 Western blotting检测各组焦亡与坏死性凋亡相关蛋白的表达Fig.3 Expression of pyroptosis and pyroptosis-related proteins (Western blotting)

坏死性凋亡发生时，相关信号通路导致MLKL发生磷酸化激活，也使得其空间构象出现改变，MLKL通过N端的四螺旋束形成寡聚化，并转位至细胞膜。pMLKL与TRMP7 细胞膜离子通道和Na+离子通道结合，引起Ca2+、Na+内流进而导致细胞肿胀、崩解[14]。MLKL的磷酸化即意味着坏死性凋亡的执行。

目前的研究发现坏死性凋亡参与了多种疾病的发生发展过程。例如在实验中观察到，当抑制了RIP1的激活后，可以减轻脑、肾脏和心脏组织的缺血再灌注损伤程度[15-17]。

而在使用肿瘤坏死因子建立的全身炎症反应综合征的动物模型中，相较于野生型动物组，坏死性凋亡抑制组动物存活率较高，脏器损害和炎症反应水平也较低[18]。在VVc处理iBMDM细胞后，Western blotting检测中可见pMLKL的表达水平上调，结合细胞上清LDH测定以及流式细胞检测结果提示其中可能发生了坏死性凋亡。为证实这一结果，本研究采用坏死性凋亡抑制剂对此进行了反向验证。

RIP1激酶在细胞坏死性凋亡通路中被激活后，RIP1暴露RHIM结构域，与RIP3相互结合形成巨大的淀粉样结构，进而导致MLKL磷酸化，促发细胞发生程序性坏死及炎症因子产生。所以RIP1是调控坏死性凋亡信号通路的关键因子。在实验中，当使用RIP1的特异性抑制剂Nec-1对iBMDM细胞进行预处理后，VVc所引起的细胞死亡率和pMLKL蛋白磷酸化水平受到抑制，这一结果从另一方面证实了VVc可导致细胞出现坏死性凋亡并且是通过RIP1信号通路激发。

本研究通过Western blotting观察到了MLKL的磷酸化水平上调，证实了坏死性凋亡的发生，且当使用RIP1的特异性抑制剂Nec-1抑制了RIPK1激酶的激活后，细胞死亡水平相应降低，提示RIP1相关的细胞坏死得到了抑制，而pMLKL相对表达量的降低则进一步揭示了Nec-1是通过RIP1/MLKL途径抑制iBMDM细胞受到VVc作用后发生的坏死性凋亡。这对进一步理解创伤弧菌的致病机制，以及针对创伤弧菌所致脓毒症的治疗提供了一条新的思路。

致谢：感谢邵峰院士、高文青博士无偿惠赠iBMDM细胞并对本研究予以帮助。

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