新型毒品THJ-018的体外代谢物及代谢途径

李 静，花镇东，王优美

（公安部禁毒情报技术中心，北京100193）

合成大麻素最初为研究其对体内大麻素系统的影响及潜在治疗价值而被合成，但之后并未成功进入临床应用[1]。据联合国毒品与犯罪办公室（UNODC）早期预警咨询处（EWA）2008—2015年的数据显示，合成大麻素类为最主要的新精神活性物质（NPS）类型，占比约35%[2]，且比例逐年增加，以2012年和2013年增幅最为显著，分别为72.9%和90.4%[3]。生物样品中合成大麻素及其代谢物的检测与定量分析对滥用的认定及毒理研究至关重要。血液、唾液、毛发中均可检测到合成大麻素的母药原体，然而其代谢物却主要存在于尿液中[4]。THJ-018（1-戊基-3-（1-萘甲酰基）吲唑，图 1）是一种吲唑类合成大麻素类新精神活性物质，多次在全球毒品缴获物中被鉴定发现。然而，因国内缺乏其药理学、毒理学、安全性及代谢的相关数据信息，检测吸食者尿液中的标志物较为困难。受到人体体内实验的限制，开展体外代谢从成本及便捷性方面来讲均更有利于其代谢物及代谢途径的评价。本研究旨在通过体外人肝微粒体模型以确定THJ-018的I相代谢物，从而为进一步的尿液代谢物分析奠定基础。

图1 THJ-018分子结构式

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与材料

待分析物 THJ-018（C23H22N2O:m/z 342.17321，由国家毒品实验室缴获物纯化）。D-葡萄糖-6-磷酸二钠盐水合物、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）钠盐水合物和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PDH）（德国Sigma Aldrich）。混合男性肝微粒体（pHLM;蛋白浓度，20mg/mL，iPhase 生物科技（北京）有限公司）。微粒体送达后于37℃解冻、分装、储存于-80℃直至使用。

图2 THJ-018的代谢轮廓TIC色谱图

图 3 THJ-018（a）和其代谢产物（b~m）的质谱图、推测结构和断裂模式

HPLC级乙腈（CH3CN）、甲醇（CH3OH）和甲酸（HCOOH，Formic Acid）（德国 Merck）；超纯水（德国 Merck 公司的Milli-Q Advantage A10自动蒸馏水机制备）。其他试剂和溶剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 色谱、质谱条件

超高压液相系统（Thermo Scientific Dionex Ultimate 3000 RSLC）串联带有热电离喷雾离子化源（HESI）的 Q Exactive Plus质谱（美国）。 色谱柱为ACQUITY UPLCR○HSST3（100×2.1mm，1.8μm），柱温为35℃；流动相为乙腈（B）-0.1%（v/v）甲酸水溶液（A），梯度洗脱程序如下:0.0～1.0min 95%A，1.0～2.5min 95%A～70%A，2.5～12.0min 70%A～1%A，12.0～13.5min 1%A，13.6～14.5min 95%A，流速为0.3mL/min。仪器在使用前进行正离子模式下的质量校准。离子源条件如下：离子传输毛细管温度，350℃；辅气加热温度，350℃；鞘气流速，35 AUs；辅气流速，10AUs；喷雾电压，3.50 kV，S-透镜 RF 水平，60.0。MS采用正离子全扫描模式，并选取特定质荷比的离子进行二级扫描。代谢物的精确分子量通过软件Thermo MetWorks 1.3 SP4.200版本计算得出。全扫描数据采集参数设置如下：分辨率，70000；自动增益控制 （AGC），1e6；最大注射时间 （IT），100ms；扫描范围，m/z70～1 050。二级质谱扫描参数设置如下：分辨率，17 500；目标物 AGC，5e5；最大IT，50ms；分离窗，m/z4.0；正态碰撞能量，20%、40%、60%。

1.2.2 体外人肝微粒体代谢模型的制备与代谢物分析

将THJ-018溶于甲醇制备成5mM的溶液，吸取1μL与新鲜配制的NADPH再生系统溶液（终体积：200μL，由 100mmol/L 磷酸盐缓冲 （pH7.4），1.3mmol/LNADP+， 3.3mmol/LG-6-P， 0.4 U/m l G-6-PDH，3.3mmol/lMg2+，1mg/mL微粒蛋白组成）混合。反应由预孵育的再生系统（3.3mmol/LMg2+，1.3mmol/L NADP+，3.3mmol/LG-6-P， 0.4U/mlG-6-PDH）的加入启动，混合物在37℃孵育60 min。然后，加入200μL乙腈，以离心半径8.2 cm，14 000 r/min,离心10min。吸取100μL上清将其转移入玻璃进样瓶中，进样量5μL。利用 TF软件 Xcalibur Qual Browser 4.0.27.10版本进行系统控制和数据采集。

将空白NADPH再生系统溶液（未加微粒蛋白及母药）溶液和未加母药的孵育反应系统溶液作为对照同样进行分析。同样进行合成大麻素THJ-018在未加入微粒体的孵育体系中的稳定性研究（37℃，1h），以确证代谢物由微粒体的引入而生成。

2 结果与讨论

2.1 THJ-018及其代谢物的寻找与分析

共检测出THJ-018的12种代谢产物，检测质量误差均在2.0 ppm以内（表1），分别是脱氢代谢物1种，加氢还原代谢物1种，合并脱氢和加氧反应代谢物1种，加氧反应代谢物9种。氧化发生在烷基链的代谢物共5种，发生在吲唑环的代谢物共3种，发生在萘环的代谢物共计1种。由代谢发生的位点及数目上来说，代谢优先发生在烷基侧链，其次是吲唑环，再次是萘环，氧化的目的是使分子极性增大，更有利于体内代谢后排出体外。图2为母药THJ-018及其代谢物的提取离子色谱图。图3阐释了所有化合物的特征碎片离子及断裂位点。根据提取离子色谱峰的峰面积，主要代谢物为加氢还原、脱氢和加氧、加氧反应产物。表1总结了孵育1h后所有代谢物的代谢反应类型、保留时间、分子离子的精确质量数[M+H]+（m/z）、理论质量数[M+H]+（m/z）、质量误差、分子式、碎片离子和峰面积。代谢物被标记为“M”，代谢反应途径由图 4所示。

图4 THJ-018在人肝微粒体中的代谢途径

表1 THJ-018在人肝微粒体孵育1h后的推测代谢产物

续表1

2.2 讨论

THJ-018的代谢产物以烷基链加氧氧化、萘环加氧氧化、羰基加氢还原及烷基链脱氢氧化和加氧氧化反应组合为主，这些代谢产物与肝细胞模型的代谢产物部分一致（即烷基链加氧反应、烷基链脱氢和加氧反应），肝微粒体代谢模型中发现了未在肝细胞代谢模型中出现的吲哚环加氧氧化反应，但并未在该实验中发现如国外肝细胞模型中发现的二相代谢产物即结合葡萄糖醛酸的代谢产物[5]，且代谢产物的含量和种类上存在明显差异。本研究建立了有效的肝微粒体模型，以及新型毒品THJ-018及代谢物的LC-MS检测方法。该方法简便快捷，为公安机关对生物检材中新型毒品THJ-018的代谢物检测提供了基础与依据。

[1]CASTANETO M S，GORELICK D A，DESROSIERSN A，et al.Synthetic Cannabinoids:Epidemiology，Pharmacodynamics， and Clinical Implications[J].Drug&AlcoholDepend，2014（144）：12-41.

[2]United Nations on Drugs and Crime.World Drug Report 2016[DB/OL].（2016-00-00）[2017-01-03].http://www.unodc.org/wdr2016/.

[3]United Nations Office on Drugs and Crime.Global Smart Update Post-UNGASS 2016:NPS Trends，Challenges and Recommendations， Volume 16.Setember[DB/OL].（2016-03-15）[2017-01-03].http://www.unodc.org/ungass2016/en/documentation.htm l.

[4]GURNEY S M R， SCOTT K S， KACINKO S L， et al.Pharmacology， Toxicology， and Adverse Effects of Synthetic Cannabinoid Drugs[J].Forensic Sci Rev， 2014，26（1）:53-78.

[5]DIAO X X，WOHLFARTH A，PANG SK，etal.High-Resolution Mass Spectrometry for Characterizing the Metabolism of Synthetic Cannabinoid THJ-018 and Its 5-Fluoro Analog THJ-2201 after Incubation in Human Hepatocytes[J].Clincal Chemistry， 2016，62（1）:157-169.