SD大鼠死后心血中大肠杆菌DNA含量与早期死亡时间相关性的研究

安志远，赵攀峰，李 聃，周怀谷，郭育林

（1.上海公安学院，上海200137；2.上海市公安局物证鉴定中心 法医物证学现场应用技术公安部重点实验室上海市现场物证重点实验室，上海200083；3.无锡中德美联生物技术有限公司，江苏 无锡214174）

死亡时间（postmortem interval， PMI）的推断一直是法医学工作实践和科研攻关的一项重、难点课题。以往的PMI推断研究主要聚焦于个体死后尸体现象和尸体内源性物质变化规律，近年来微生物在尸体腐败过程中的作用成为了一项研究热点。大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）是人和动物肠道中的正常栖居菌，婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终身相伴。在个体死后，大肠杆菌属于具有较强分解蛋白质能力的腐败菌种，且由于其周身鞭毛能运动，最易出现细菌移位（bacterial translocation， BT）[1-3]。故本实验对SD大鼠心血中大肠杆菌LacZ基因含量的检测方法及其随PMI变化的规律进行了一系列初步研究，探讨利用心血中LacZ基因含量推断PMI的可行性。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

EZ1 DNA Investigator Kit（美国 Promega 公司）；Taq DNA 聚合酶（5U/μl，Takara），10×BufferMg2+plus，dNTPs（2.5mM），pMD18-T vector Cloning Kit（宝生物工程（大连）有限公司）引物和Taqman探针（生工生物工程（上海）股份有限公司）；荧光定量PCR仪为ABIPISM-7900HT扩增系统；分光光度计（Thermo Scientific NanoDrop 2000c）；EZ1 Advanced XL（美国Promega公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠心血DNA样本采集

18只健康SD大鼠，雌雄不限，体重180～200 g。控制室内环境温度25℃，适应性饲养3 d颈椎脱位法处死，按PMI随机分成9组，每组2只，其中1组对照组（死后 0 h），8 组实验组（PMI分别为：12、24、36、48、60、72、84、96 h），置于密闭室内，分别在各时间点取心血100μL，然后应用EZ1 Advanced XL按照EZ1 DNA Investigator Kit说明书进行操作提取心血DNA，最终每组得到DNA洗脱液100μL，-20℃冰冻保存备用。

1.2.2 菌种获取

E.coliDH-5α（无锡中德美联生物技术有限公司）。

1.2.3 引物及探针

在NCBI上获取已有E.coli的 β-D-半乳糖苷酶合成基因LacZ的序列，选择较保守的一段序列构建探针及引物体系（表1），设计应满足以下几个条件：（1）引物 Tm 值 58～60 ℃；（2）探针 Tm 值 68～70℃；（3）G+C 在 30%～80%之间；（4）引物和探针没有连续3个以上的碱基G；（5）探针5’端第1个碱基不是 G；（6）探针序列中 C 大于 G；（7）扩增片断在50～150 bp之间。

表1 大肠杆菌LacZ基因荧光定量PCR引物和探针序列

1.2.4 标准品质粒的制备

选取E.coli的 β-D-半乳糖苷酶合成基因LacZ上大片段克隆引物（LacZ-DF1和LacZ-DR1）（表2），对模板大肠杆菌D-H-5α进行直接扩增获得PCR产物，经过连接、转化，筛选出所需菌种，并进行测序比对验证，证实重组质粒与设计片段的目标序列完全一致，符合设计要求。

表2 大片段克隆引物的寡核苷酸序列

1.2.5质粒浓度测定

将重组质粒提取物以去离子水稀释，于紫外分光光度计上进行定量，测定其在260nm与280nm的A值，判断其纯度（A260/A280＞1.8为纯品）。 取1μL提取质粒，加入 Nano Drop（Thermo）上，测定三次，然后得出质粒浓度（表3）。

1.2.6 线性标准曲线的建立

以提取的LacZ基因克隆转化菌质粒DNA为模板标准，将其10倍梯度稀释形成浓度为3.747、0.3747、37.47、3.747、0.3747、0.03747 pg/μL，取各稀释梯度模板1μL进行荧光定量PCR扩增，反应体系20μL，均为三个复孔，在PCR过程中由实时荧光定量PCR仪自动绘制线性标准曲线（图1）。

图1 扩增曲线图

以克隆质粒模板浓度的对数值为横坐标，以Ct值为纵坐标建立LacZ荧光定量PCR检测的标准曲线（图2）。曲线回归得标准曲线方程为：Ct=-3.41lgX+25.46（直线斜率 A=-3.41，截距 B=25.46，X 为模板浓度，单位 pg/μL），曲线相关系数r=0.9985，说明标准曲线线性较好。根据A=-1/log（1+E）（E为荧光定量PCR反应的扩增效率），得荧光定量PCR扩增效率为96.34%，符合荧光定量PCR对扩增效率的要求。

图2 标准曲线线性拟合图

1.2.7 qPCR扩增体系及程序

用 2×Mastermix10μL、10μM YF1 1μL、10μM YR1 1μL、10μM Taqman 0.4μL、模板 1μL和ddH2O 6.6μL配置成20μL的扩增体系。

设置扩增程序：（1）50℃，持续 2min；（2）95℃，持续 10min；（3）95℃，持续 15 s；（4）60℃，持续 1min；（5）（2）～（4）步骤 40 个循环。

2 结果

2.1 SD大鼠尸体变化

SD大鼠处死后18 h，有轻微异味产生。死后72 h，尸体腹部出现肿胀，口腔开始有腐败液体流出，臭味明显，尸体表面可见脱毛现象，腹部有尸绿形成。死后96 h，尸体皮肤下有腐败静脉网形成。

2.2 SD大鼠心血DNA样本的浓度测定

用分光光度法分别测量不同PMI下SD大鼠心血样本DNA浓度，取1μLDNA样品，加入Nano Drop（Thermo）上，检测每组样本 DNA浓度，取平均值（表 4）。

表3 质粒标准品浓度测定

表4 SD大鼠死后96 h内心血样本DNA浓度测定

对上述样本的检测浓度绘成线性趋势图，检测结果显示在SD大鼠死后96 h时间段内，死后12 h DNA浓度开始增高，死后60h增速加快，至死后96h达到高峰。对SD大鼠死后96 h心血DNA浓度变化值经过EXCEL软件相关分析，得出回归方程式：y=1.0233x+31.647，PMI与DNA浓度的决定系数R2=0.9345，表明DNA浓度随着PMI的延长而呈增加趋势，两者之间存在着较强的正相关（图3）。

图3 SD大鼠死后96 h内心血样本DNA浓度变化趋势图

2.3 SD大鼠心血DNA样本qPCR

对PMI为0～48 h的5个时间点SD大鼠心血样本进行检测。根据标准曲线定量结果，几乎均无扩增，类似阴性，初步得出，PMI为0～48 h，扩增 Ct值均在35以后，说明SD大鼠心血中未有LacZ基因的存在（图4）。

图4 PMI为0～48h SD大鼠心血样本LacZ基因检测图谱

对PMI为60～96 h的4个时间点SD大鼠心血样本进行检测，同批次扩增标准品，制备标准曲线，根据标准曲线定量结果，发现各时间点的样本均有扩增产物出现（图 5～6）。

图5 标准品质粒扩增图谱

图6 PMI为60～96h SD大鼠心血样本LacZ基因检测图谱

以标准品浓度梯度稀释的对数值为横坐标，以Ct值为纵坐标建立LacZ荧光定量PCR检测的标准曲线（图7）。曲线回归得标准曲线方程为：Ct=-3.65lgX+27.04（直线斜率 A=-3.65，截距 B=27.04，X 为模板浓度，单位 pg/μL），曲线相关系数r=0.9822，说明标准曲线线性较好。根据A=-1/log（1+E）（E为荧光定量PCR反应的扩增效率），得该次荧光定量PCR扩增效率为88%，符合荧光定量PCR对扩增效率的要求。根据标准曲线，可计算出实际样本中LacZ基因的浓度，图中标“×”为实际样本扩增在标准曲线线性拟合图中的位置。

图7 标准曲线线性拟合图（标×位置为实际样本）

按照上述标准曲线，对60～96 h的4个时间点心血样本检测，每组样本基因浓度取平均值（表5）。

表5 SD大鼠死后60～96 h心血样本中LacZ基因浓度

对上述定量检测样本中LacZ基因的趋势图（图8）检测结果显示在SD大鼠死后60 h LacZ基因浓度开始增加，随着PMI的延长呈指数式增长，至死后96 h达到高峰。对SD大鼠死后60～96 h心血DNA样品检测LacZ基因浓度变化值经EXCEL软件相关分析，得出回归方程式：y=3E-06e0.1567x，PMI与DNA浓度的决定系数R2=为0.9569，表明DNA浓度随着PMI的延长而呈增加趋势，两者之间存在着较强的正相关。

图8 SD大鼠死后60～96 h心血DNA样本中LacZ基因浓度变化趋势图

3 讨论

个体死亡后，抑制微生物生长的平衡被打破，腐败菌开始大量繁殖，并在尸体腐败的进程中起主导作用。2009年刘茜[4]利用生物发光法检测大鼠死后不同时间点尸体组织中微生物ATP含量，初步证实在大鼠尸体上腐败菌存在着量的变化性规律。但是ATP检测只能反映存活状态细菌的数量，不能反应出死亡细菌的数量，而且其在死后早期易受个体本身ATP的干扰。2014年谢丹[5]通过检测尸体不同部位的腐败菌多样性的演替规律，发现利用优势菌群的演替变化可用于推断PMI，但是该研究只是对优势菌群的种属做了定性鉴别，而没有相关的定量研究，因此推断的PMI只能是大概的一个时间段，精确性不高且需检测的指标偏多。

笔者认为，在尸体腐败降解过程中，无疑存在着腐败菌数量的变化，通过检测腐败菌DNA含量更能准确反映出腐败菌的变化情况，而目前国内外学者应用qPCR技术定量检测大肠杆菌的研究主要集中在疾病诊断治疗和食品卫生安全等方面[6-8]，本研究将检测大肠杆菌DNA含量的技术应用到法医学PMI推断中来，在国内外研究中罕见报道。

本研究成功的用紫外分光光度计分别检测了SD大鼠死后0～96 h的心血DNA样本浓度，结果显示随着PMI的延长，样本DNA浓度呈现线性增长的趋势，与PMI呈显著正相关，这可能与个体死后水分流失有关，心血管内血液中的水分等细小分子受重力的影响向外向下渗透，致使血液发生浓缩，血样本的DNA浓度随着升高，因此个体死后在一定的时间范围内检测心血总DNA浓度可用于推断PMI。

细菌的生长繁殖分为4个时期：迟缓期（又叫调整期）、对数期（又称指数期）、稳定期和衰亡期。本研究在SD大鼠死后0～48 h的心血DNA中，均未检测到LacZ基因的扩增，可能的结果有两个：（1）心血中没有大肠杆菌繁殖，自然不会出现LacZ基因扩增；（2）心血中有大肠杆菌，只是处于迟缓期，基因浓度很低，本研究RT-PCR的基因浓度检测限是≥0.003747pg/μL，而 NTC 的浓度是 0.02pg/μL，可能的原因是扩增试剂本身（如Taq酶来源于大肠杆菌，而目前的提取技术不可能达到完全纯化[9]）存在少量大肠杆菌基因组的污染而带来假阳性的结果，为此本研究人为将基因含量检测限提高到是≥0.03747 pg/μL，使所测Ct值与NTC没有重叠，不过这样也可能造成了一定几率的假阴性结果产生，导致迟缓期基因扩增结果不明显。

本研究成功建立了检测大肠杆菌LacZ基因含量的qPCR方法，结果显示SD大鼠死后60～96 h心血中大肠杆菌DNA含量与PMI呈显著正相关，LacZ基因浓度呈指数式增长，这与细菌的二分裂繁殖方式有关，符合细菌的生长曲线规律中对数期（又称指数期）的特征。值得一提的是，本实验测定大肠杆菌LacZ基因含量是不区分细菌死活状态的，无论死亡细菌或存活细菌均能检测到LacZ基因，这点不同于一般的根据存活细菌数量绘制的细菌生长曲线规律，因此死后96 h以后能否出现细菌生长的稳定期和衰亡期特征还值得进一步的研究。由于本实验对象SD大鼠的心血存量受限，超过96h的心血难以提取到，故笔者认为为了更好地验证本研究的实际应用价值，有必要进一步研究不同死亡时间点上的人类尸体与SD大鼠尸体的异同点，并根据预实验心血存量结果，适当延长样本检测PMI时间点，以更大地发挥大肠杆菌LacZ基因含量推断PMI的作用。

[2]BERG R D.Bacterial Translocation from the Gastrointestinal Tract[J].Trends in Microbiology， 1995， 3（4）:11-30.

[3]O’BOYLE C J.Microbiology of BacterialTranslocation in Humans[J].Gut， 1998， 42（1）:29-35.

[4]刘茜.腐败微生物及腐败产物检测推断死亡时间的研究[D].湖北：华中科技大学，2009.

[5]谢丹.SSOs演替用于PMI推断的法医学研究[D].湖南：中南大学，2014.

[6]ONO S，TSUJIMOTO H，YAMAUCHIA，et al.Detection of Microbial DNA in the Blood of Surgical Patients for Diagnosing Bacterial Translocation[J].World Journal of Surgery，2005，29（4）:535-539.

[7]李云玖，马恩陵，廉东波，等.实时定量PCR检测外科发热患者静脉血中大肠杆菌DNA的方法[J].中国临床营养杂志， 2006， 14（2）:70-76.

[8]周微，张伟钦，付宇，等.荧光定量PCR方法快速检测原料乳中的大肠杆菌[J].中国乳品工业，2009，37（11）:39-42.

[9]HARRISK A，HARTLEY JC.Developmentof Broad-range 16S rDNA PCR for use in the Routine Diagnostic Clinical Microbiology Service[J].Journal of Medical Microbiology，2003，52（8）：685-691.