重庆地区山羊痘病毒分离鉴定及其动物模型构建

丁玉春，林 玲，罗 林，张成刚，吴 梦

（重庆市畜牧科学院，重庆 402460）

山羊痘是由山羊痘病毒引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，病原为痘病毒科、脊椎动物痘病毒亚科、山羊痘病毒属，是一种大型病毒［1-3］。山羊痘又称“羊天花”，可感染多个年龄段、不同品种的山羊，多发于羔羊，无明显季节性，但冬末春初最易流行［4］。感染该病毒后羊只多见全身性的丘疹、结节或水泡，并伴随内脏性病变，严重者出现死亡，给养殖业造成巨大的经济损失［5-6］。整个病程经丘疹、水泡和结痂一般可持续3～4周，病羊痊愈后可以获得终身免疫［7］。山羊痘对宿主具有一定的特异性，自然感染多发生于山羊，其特异性与毒株自身特性密切相关，仅有少量毒株使绵羊发病，偶尔感染人［8-9］。

目前，羊痘疫苗多为弱毒苗，由于国内疫苗产品质量参差不齐，弱毒苗常出现返强，导致羊只发病，严重者造成疫病的流行［10-13］。并且，山羊痘病毒地区差异性较大，疫苗产品在不同地区的应用效果各有差异［11］，因此，对山羊痘病毒新毒株的研究十分必要，尤其对地方毒株的研究更加重要。笔者等对重庆地区山羊痘病毒进行了分离鉴定，并构建了动物模型，为羊痘致病机理的研究奠定了基础，也为羊痘疫苗新产品的研发提供了依据。

1 材料与方法

1.1 试剂

病毒DNA提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒、DL 2000 DNA Marker、2×Taq PCR Master Mix 均 购 自Solarbio公司；依据NCBI中公布的山羊痘病毒P32基因设计特异性引物F1/F2，序列由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列信息见表1。

表1 引物序列信息

1.2 病料及实验动物

病料及实验动物均由重庆市荣昌区某羊场提供。

1.3 方法

1.3.1 病料的处理 对疑似山羊痘感染羊只进行临床诊断，采集病变部位丘疹或痂皮，按1∶5的比例加入含有双抗的PBS溶液，用研钵研磨，收集研磨液，反复冻融3次后，3 000 r/min离心30 min，将上清经0.45 μm滤器过滤，收集滤液，-20℃保存备用。

1.3.2 P32基因序列PCR鉴定及测序分析 参照病毒DNA提取试剂盒说明书，提取1.3.1中收集的样本DNA。利用特异性引物F1/F2进行羊痘病毒P32基因序列的PCR扩增。PCR反应体系：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，引物 F1/F2各 0.5 μL，模板 5 μL，ddH2O 19 μL。PCR反应条件：94℃预变性2 min；95℃变性45 s，58℃退火 45 s，72℃延伸 45 s，30个循环，72℃延伸 10 min。反应结束后，进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，PCR产物经DNA胶回收试剂盒回收后，送往生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序分析。

1.3.3 遗传进化分析 将测序结果在NCBI中进行BLAST比对，分析其与羊痘病毒P32基因的同源性，利用N-J法将分离株序列与其相关性较好的序列进行比对，借助MEGA5.软件构建系统进化发育树。

1.3.4 病毒的纯化培养

1.3.4.1 病毒细胞培养 将鉴定为阳性的病料研磨液接种单层BHK21细胞，接毒量与维持液的比例为1∶10，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，观察记录细胞病变情况。若细胞在接种病料后5 d内未出现病变则连续盲传3代，若第5代仍未出现病变则视为阴性，出现病变的反复冻融3次后收毒，置-80℃保存。

1.3.4.2 病毒TCID50测定 将BHK21在96孔板中培养，待细胞长成单层时，将病毒液按照10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10浓度连续 10 倍稀释后，接种于96孔板细胞培养板，每一稀释浓度接种一列，第11、12列作为细胞空白对照，每孔接种100 μL，37℃、5%CO2培养箱中培养，每天观察细胞产生病变孔数，记录结果，根据Reed-Muench氏法计算病毒TCID50值。

1.3.5 动物模型的构建 选取未免疫山羊痘疫苗的3月龄健康羔羊2只，用皮下划痕和多点皮内注射法，将山羊痘病毒接种健康羔羊1只，接种量为0.5 mL，另外1只羔羊接种生理盐水作为对照组，均正常饲喂，逐日观察记录羔羊发病情况，同时记录羔羊体重、体温（直肠温度）变化。

2 结果与分析

2.1 山羊痘病毒PCR鉴定及测序结果

PCR鉴定结果表明，在约800 bp的位置出现特异性条带（见图 1），经测序，其大小为 815 bp（见图 2），与预期结果一致。

图1 山羊痘病毒P32基因PCR鉴定结果

2.2 进化树

将所得基因序列在NCBI中进行BLAST比对后，发现其与山羊痘病毒（登录号AY881707.1）P32基因序列同源性最高（99%），在系统进化发育树中也与其聚为一簇。结果见图3。

图2 山羊痘病毒P32基因测序结果

图3 基于山羊痘病毒P32基因序列构建的系统进化发育树（Isolate strain为分离株序列）

2.3 山羊痘病毒细胞培养

病毒接种BHK21细胞盲传至F4代时，细胞开始出现病变，培养至48 h时，细胞出现拉丝结网、固缩变圆和脱落的现象，72 h时出现空斑，结果见图4～6。对稳定传代的病毒进行TCID50检测，结果为1×10-4.5/mL。

图4 正常BHK21细胞形态

图5 接毒山羊痘病毒48 h BHK21细胞形态

图6 接毒山羊痘病毒72 h BHK21细胞形态

2.4 动物模型

2.4.1 发病情况 通过对羔羊人工感染山羊痘病毒发现，羔羊在接毒10 d后，唇部和尾根部出现红色丘疹和水泡（见图7～8），食欲开始减退，精神不振，出现羊痘初期症状，第15天形成痂皮，进入结痂期，第28天结痂开始脱落，第35天时，羔羊病情好转。整个病程中，羔羊体重变化差异不大，未出现死亡。

2.4.2 体温变化 通过对攻毒后羔羊直肠温度进行检测发现，接种部位划痕在第4天愈合，第7天开始出现体温升高，第16天达到最高（42℃），第26天时体温趋于正常，体温变化见图9。

图7 人工感染山羊痘病毒羔羊唇部初期症状

图8 人工感染山羊痘病毒羔羊尾根部初期症状

图9 人工感染山羊痘病毒羔羊体温变化

3 讨论

本研究应用临床诊断、分子鉴定、细胞培养、遗传进化分析和构建动物模型等方法，分离到一株重庆地区山羊痘病毒，并对其细胞培养特性和致病性进行了初步研究，结果表明，分离纯化到的山羊痘病毒可以在BHK21细胞中稳定增殖，并出现典型的细胞病变，这为该病毒的进一步研究奠定了基础。研究表明，不同山羊痘病毒在攻毒家兔、豚鼠和鸡胚时，表现出的症状各有差异，仅有部分毒株可以使家兔和豚鼠形成局部痘斑，少数毒株可以在鸡胚尿囊膜上出现典型的痘斑［14-16］，说明不同的山羊痘病毒存在较大差异，也表明本研究的必要性。将山羊痘病毒接种3月龄健康羔羊后，羔羊在攻毒第7天时，开始出现体温升高、精神不振等症状，在第16天时体温达到42℃；攻毒第10天，羔羊表现出山羊痘的初期症状，第35天时病情好转，整个病程中，羔羊体重变化差异不大。通过动物模型的构建，发现羔羊未出现皮肤全身性的病理变化，也未出现死亡。目前，关于山羊痘重庆地区分离株的报道相对较少，本研究为山羊痘地方株疫苗的研究奠定了基础，也为重庆地区山羊痘的防控提供了理论依据。

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