二丁酰环磷腺苷钙有关物质分析和鉴定

丁金国 贾存宇 黄臻辉

摘 要 目的：建立反相高效液相色谱法（RP-HPLC）分析二丁酰环磷腺苷钙的有关物质，并对其中的杂质进行鉴定。方法：采用反相梯度色谱系统对二丁酰环磷腺苷钙中的有关杂质进行分离，对其中的主要杂质采用四级杆飞行时间质谱（Q-TOF）进行多级质谱分析，鉴定结构。并采用红外光谱、核磁进一步确证。结果：在该条件下，二丁酰环磷腺苷钙主峰与有关物质分离良好，其中的主要有关物质鉴定为2′-O-单丁酰环磷酰苷钙。结论：本研究为二丁酰环磷腺苷钙有关物质研究提供了新的分析方法，可用于二丁酰环磷腺苷钙的质量控制。

关键词 二丁酰环磷腺苷钙 有关物质 HPLC Q-TOF

中图分类号：R917 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2018）09-0073-04

Analysis and identification of the related impurities in the calcium dibutyryladenosine cyclophosphate

DING Jinguo*， JIA Cunyu， HUANG Zhenhui

（SPH No.1 Biochemical & Pharmaceutical Co.， Ltd.， Shanghai 200240， China）

ABSTRACT Objective： To establish an HPLC method for the analysis and identification of related impurities in calcium dibutyryladenosine cyclophosphate. Methods： The related impurities were isolated by reversed-phase high-performance chromatography， in which the major impurities were identified by Q-TOF and verified by IR and NMR. Results： The related impurities were well separated and the major impurity was identified as 2′-O-butyryladenosine cyclophosphate. Conclusion： The established method for the analysis of the related impurities can be used for the quality control of calcium dibutyryladenosine cyclophosphate.

KEy WORDS calcium dibutyryladenosine cyclophosphate； related impurities； HPLC； Q-TOF

环磷腺苷具有体内激素的传导功能，对许多生理过程起着重要调节作用，如心肌细胞内环磷腺苷的升高会引起正性肌力效应，也作为药物用于心血管疾病治疗[1]。二丁酰环磷腺苷钙是环磷腺苷的N6-2′-O-二丁酰化衍生物，脂溶性增强，有利于穿过细胞膜进入细胞内发挥药理作用。二丁酰环磷腺苷在细胞内代谢为环磷腺苷，也能抑制磷酸二酯酶对环磷腺苷的快速降解，从而增加细胞内环磷腺苷浓度，药效比环磷腺苷迅速，作用也较持久，且具有更佳体内药物浓度分布和代谢动力学特性。临床上广泛用于心绞痛、急性心肌梗死的治疗，也用于心肌炎、心源性休克，手术后网膜下出血和银屑病，并可辅助其他抗癌药治疗白血病[2-6]。

本文建立了反相高效液相色谱法对二丁酰环磷腺苷钙中的有关物质进行分离，并对主要有关物质进行结构鉴定，为二丁酰环磷酰苷钙质量控制提供专属、快捷的分析方法，也为改进工艺控制、减少有关物质生成提供了研究基础。

1 材料和方法

1.1 材料

色谱级甲酸铵购自美国Fluka公司；色谱级甲酸购自美国ROE公司；色谱级乙腈购自美国Fisher公司；二丁酰环磷酰苷钙为本公司自制产品；水为双蒸水。

1.2 仪器

Waters alliance 2695高效液相色谱仪、 Waters 2489 UV/ Vis检测器和Empower 2数据处理系统、Acquity UPLCQTOF Premier超高效液相色谱-质谱联用仪和Masslynx數据处理系统均购自美国Waters公司；XS-205 DU电子天平（梅特勒-托利多中国公司）； Nicolet 6700傅里叶红外光谱分析仪（美国Thermo-Fisher Scientific公司）；Avance Ⅲ 400 MHz核磁共振波谱仪（德国Bruck公司）。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件与系统适应性

色谱柱：Diamonsil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 mm）；流动相A为甲酸-甲酸铵水溶液（缓冲盐浓度10 mol/L，pH 3.0）-乙腈（90∶10），流动相B为乙腈；梯度洗脱条件：0～5 min时流动相B从0%增加到15%，5～10 min时B从15%增加到22%，10～11 min时B从22%增加到25%，11～12 min时B从25%增加到30%，12～13 min时B从30%增加到90%，13～17 min时B为90%，17.5 min时B回到0%；流速：1 ml/min；柱温：30 ℃ ；检测波长：273 nm；进样量：20 ml。此条件下二丁酰环磷酰苷钙主峰的保留时间为11.5 min左右，主峰与前后杂质峰分离度大于1.5，理论塔板数按主峰计算大于10 000。

1.3.2 供试品贮备液

精密称取二丁酰环磷酰苷钙50 mg，置50 ml量瓶中，加流动相A溶解并稀释至刻度，摇匀，得到1 mg/ml溶液作为供试品贮备液。

1.3.3 方法专属性考察

1）各组分分离情况 精密称取样品粗品，配成1 mg/ml粗品溶液，进样20 ml，记录色谱图。

2）强制降解试验 分别将样品进行酸、碱、氧化、高温、强光照射等强制降解试验，依次进样20 ml，按1.3.1项下色谱条件进行分析并记录色谱图。①酸破坏：称取样品约20 mg，置20 ml量瓶中，加1 mol/L的盐酸溶解，室温放置1 h，并用适量氢氧化钠溶液中和，再用流动相A稀释至刻度，摇匀并进样；②碱破坏：称取样品约20 mg，置20 ml量瓶中，加10 mmol/L的氢氧化钠溶液溶解，室温放置10 min，并用相应的盐酸溶液中和，再用流动相A稀释至刻度，摇匀并进样；③氧化降解：称取样品约20 mg，置20 ml量瓶中，加10%双氧水溶液溶解，室温放置0.5 h，再用流动相A稀释至刻度，摇匀并进样；④高温破坏：取供试品贮备液10 ml，于100 ℃水浴加热3 h后取出，冷却至室温进样；⑤强光破坏：取供试品贮备液10 ml，于4 500 Lx ± 500 Lx下放置6 d进样。

1.3.4 质谱分析

将二丁酰环磷腺苷钙进行热破坏降解，在HPLC上过载上样对其进行富集，通氮气使浓缩得到一定量的杂质纯品，进行质谱分析。

色谱柱为Waters Acquity BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm， 1.7 mm），串联质谱离子源为电喷雾离子源，正离子模式，毛细管电压为3.0 kV，离子源温度为100 ℃，雾化气温度为350 ℃，雾化气流量为600.0 L/h，碰撞电压分别为4.0 eV（MS）和15.0～30.0 eV（MS/MS），扫描范围m/z 100～1 000。

1.3.5 红外光谱和核磁条件

红外光谱采用KBr压片制样。核磁共振采用氘代DMSO为溶剂。

2 结果

2.1 色谱分离及方法专属性考察

采用粗品进行1.3.1所述色谱方法专属性考察，观察各组分之间的分离情况，色谱图见图1。结果表明，在该色谱条件下，二丁酰环磷腺苷钙主峰与各杂质峰分离度良好。

各强制降解试验获得的降解产物的色譜图见图2，发现二丁酰环磷腺苷钙对酸、氧化、热和光照比较稳定，对碱反应比较灵敏，稀碱溶液处理10 min后降解较剧烈，相关杂质增加明显，但各条件下主峰与前后杂质峰分离度良好，分离度均大于1.5，不干扰样品的测定，表明该方法专属性良好。

2.2 质谱检测结果

在二丁酰环磷腺苷钙色谱图中，保留时间7.9～8.1 min左右处有一杂质峰，为其主要有关物质，对该杂质进行质谱分析表明，正离子模式下，一级质谱m/z 400.102 9为准分子离子峰[ M + H ]+。经软件测算，分子式C14H19N5O7P的匹配误差小于百万分之2，初步推断为N6-单丁酰环磷腺苷或2′-O-单丁酰环磷腺苷。[ M+ H ]+经低能碰撞诱导解离，得到五个主要碎片离子信息。可能的裂解规律如图3所示，其中m/z 136.06 0相应分子式为C5H6N5 （图3 A），即腺嘌呤；m/z 265.043相应分子式为C9H14O7P（图3 B），即2′-O-丁酰化环磷酸核糖残基，二者为单丁酰环磷腺苷的C-N糖苷键断裂所致；然后结构B上2′-位酯键断裂失去丁酰基，得到相应碎片离子m/z 195.005，分子式为C5H8O6P（图3 C）；再经失水重排、脱HPO3产生碎片离子m/z 97.027 7 和m/z 176.994，相应的分子式依次为C5H6O5P（图3 D）、C5H5O2（图3 E）。从二级质谱信息中未发现N6-丁酰化有关的碎片峰。通过上述分析可初步判断二丁酰环磷腺苷钙的主要有关物质为2′-O-单丁酰环磷腺苷。

2.3 红外光谱和核磁共振分析

IR各主要吸收峰归属：1 743 cm-1为2′-位酯C=O伸缩振动峰；1 092 cm-1为酯C-O-C伸缩振动峰；1 693 cm-1为C=N伸缩振动峰；1 643 cm-1为N-H面内弯曲振动峰；1 249 cm-1为C-N伸缩振动峰。

核磁共振各信号归属：δ=8.39（s， 1H）； 8.25（s， 1H）； 7.72（s， 2H）； 6.22（s， 1H）； 5.77-5.78（d， 1H）； 5.21-5.25（m， 1H）； 4.40-4.49（m， 1H）； 4.16-4.21（m， 1H）； 4.05-4.11（m， 1H）； 8.39（s， 1H）； 2.41-2.44（t， 2H）； 1.56-1.62（m， 2H）； 0.90-0.94（t， 3H）。共17个H，δ0.9-2.5为丁酰基相应氢原子，δ4.0-6.3为呋喃糖相应氢原子，δ7.0-8.5为腺嘌呤相应H。其中δ=7.72处为N6-位氨基的两个质子，由于受共轭效应影响显著，化学位移向低场移动。

3 讨论

经紫外全波长扫描二丁酰环磷腺苷钙在272.5 nm处有最大吸收，选择273 nm作为检测波长。通过不同流动相组合如甲酸系统、磷酸盐缓冲系统等的筛选，发现缓冲盐系统对产品的分析较好，考虑杂质鉴定中采用质谱的因素，选用挥发性甲酸铵和甲酸缓冲系统对样品进行分析。并通过不同pH条件下分离度的考察，发现样品在pH 3.0时有较好的分离度，理论塔板数和拖尾因子等均较好。在二丁酰环磷腺苷钙粗品中存在强疏水性的物质，选用甲醇无法将其完全洗脱，故采用乙腈对其进行洗脱，效果良好。

LC-MS技术，尤其是LC-MS/MS在化合物定性分析方面具有强专属性和高灵敏度等特点[7-10]。在本文中采用该技术对二丁酰环磷腺苷钙的最大单个杂质进行结构推断，并用红外光谱和核磁进行确证。LC-MS/MS方法经适当优化后还能对其他有关物质进行结构解析，但由于含量较低，不易获得足够样品进行红外光谱和核磁检测，按解析结构合成样品进行结构确证或许能弥补该方法的不足。监测工艺过程表明，2′-O-单丁酰环磷腺苷为二丁酰环磷腺苷钙的水解产物。该工作为改进工艺控制、减少有关物质生成提供了研究基础。

致谢：感谢霍建丽、耿敏对本文的贡献。

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