鸡肉中四环素类抗生素兽药残留量检测

□ 富 玥 内蒙古自治区巴彦淖尔市食品药品检验所

四环素包括四环素、土霉素、金霉素等，在较高浓度时其具有良好的杀菌作用。但是在近年来发现该类药物可影响新生儿骨、牙的生长。久用四环素类可引起畜禽等动物机体的正常菌群减少，导致维生素缺乏症，引起真菌繁殖，或引起二重感染。抗生素类药物还是常见的致肝损伤药物，在各类药物性肝损伤的发病因中占首位。

本文根据四环素类抗生素的性质采用市售成品中性HLB小柱作为固相萃取柱，用EDTA-Mcllvainc缓冲溶液进行低温提取。以不易损失、灵敏度高的液相色谱-串联质谱作为定性、定量手段，建立了一种回收率高、快捷、灵敏、稳定的检测方法，为鸡肉中四环素类抗生素检测提供参考方法和依据。

1 材料与方法

1.1 仪器设备

超高相液相色谱-质谱联用仪：UPLC I-CLASS/Xevo TQ-S；色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18 （1.7 μm，2.1 mm×50 mm）；高速冷冻离心机：HC-3018R；旋涡振荡器：XW-80A；氮吹仪：OA-SYS；纯水机：PCJ-40。

1.2 材料与试剂

四环素类抗生素对照品，四环素纯度98.4%；土霉素纯度88.8%；金霉素纯度94.1%；乙腈、甲醇为色谱纯；乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸、磷酸氢二钠均为分析纯；水为去离子水，由PCJ-40制得；固相萃取小柱：Oasis HLB固相萃取柱，60 mg/3 mL；柠檬酸溶液：0.1 mol/L，称取10.55g柠檬酸，用水溶解，定容至500 mL；磷酸氢二钠溶液：0.2 mol/L，称取14.2 g磷酸氢二钠，用水溶解，定容至500 mL；Mcllvainc缓冲溶液：将500 mL 0.1 mol/L柠檬酸溶液与313 mL磷酸氢二钠溶液混合，必要时用氢氧化钠或盐酸调节pH=4.0±0.05；EDTA-Mcllvainc缓冲溶液：称取30.3 g乙二胺四乙酸二钠放入813 mL Mcllvainc缓冲溶液中，溶解，摇匀。

1.3 试验方法

1.3.1 标准溶液的配置

准确称取51.0 mg三种四环素类抗生素于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配置成1.0 mg/mL的标准储备液，冷冻保存。

1.3.2 仪器条件

流动相：A为0.01%甲酸水，B为0.3%乙腈。0～7 min，90%A线性变化至70%A；7～8 min，70%A线性变化至90%A；8～10 min，90%A。流速0.2 mL/min；柱温：30 ℃；进样量 5 μL。

质谱条件：电喷雾离子源（ESI）电离，正离子模式扫描，多反应监测（MRM）模式检测；离子源温度150 ℃；脱溶剂气温度350 ℃；脱溶剂气流速650 L/hr；锥孔气流：150 L/hr；碰撞气为氩气。

化合物的检测离子对（m/z）、锥孔电压等质谱参数见表1。

1.3.3 样品提取

取鸡肉样品10 000 r/min均质1 min试料2 g，置50 mL容量瓶中，加入EDTA-Mcllvainc缓冲溶液8 mL，旋涡混匀2 min，10 000 r/min离心10 min（温度低于10 ℃），取上清液于另一离心管内，重复提取一次，合并上清液，待净化。

1.3.4 净化

取Oasis HLB 固相萃取柱（60 mg/3 mL），依次用3 mL甲醇、3 mL水活化，加入8 mL提取液过柱，用3 mL水、3 mL 5%甲醇水溶液淋洗，减压抽干3 min。用5 mL甲醇洗脱，氮气吹至近1 mL（温度低于30 ℃），用甲醇补至1 mL，过0.22 μm滤膜待测。

2 结果与讨论

2.1 提取溶液的选择

由于四环素类药物中含有许多羟基、烯醇羟基及羰基，在中性条件下能与多种金属离子形成不溶性螯合物。用EDTA-Mcllvainc缓冲溶液作为提取液可防止四环素类抗生素形成螯合物，更好提取该物质。

2.2 色谱柱及流动相的选择

Inertsil C8-3色 谱 柱（5 μm，2.1 mm×150 mm）柱中的粒径较大，对物质保留较差，导致过早出峰以及分离度太小，影响出峰。采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（1.7 μm，2.1 mm×50 mm）可有效分离三种抗生素且在合适的时间段出峰。

由于使用ESI+电离源，本实验用甲酸代替了FTA，发现使用甲酸也可以有较好的峰型和保留时间，见图1。并且比对了在水中添加0.3%甲酸和0.01%甲酸时各待测物的色谱图。三种

表1 3种四环素类抗生素质谱参数

图1 3种四环素定性、定量离子色谱图

注：A为金霉素定性离子色谱图；B为金霉素定量离子色谱图；C为土霉素定量离子色谱图；D为土霉素定性离子色谱图；E为四环素定性离子色谱图；F为四环素定量离子色谱图；G为总离子色谱图待测物的保留时间随着甲酸含量增加而缩短，峰宽和峰高也随之变窄和变高，信噪比增加，但考虑到保留时间过短容易受实际样品预先流出的杂质干扰，本实验选择甲酸的添加量为0.01%。

表2 三种四环素类抗生素线性范围、回归方程、相关系数及检出限

表3 3种四环素类抗生素的平均回收率、相对标准偏差

2.3 标准曲线与检出限

配置三种四环素类抗生素浓度为20、50、70、100、130、150、200 μg/L混合基质添加标准工作液，以定量离子峰面积为纵坐标（Y），以对应浓度为横坐标（X）进行线性回归分析，得到线性回归方程。空白样品中加入低浓度标准对照溶液，以信噪比（S/N=3）计算三种待测物的检出限，结果见表2。

2.4 精密度与回收率

在2.0 g空白鸡肉样品中添加3种四环素类抗生素标准工作液，使其含 量 分 别 为 50、100、200 μg/L， 做6份平行实验，并计算相对标准偏差RSD%，结果见表3。

3 结论

本文采用了市售HLB小柱为固相萃取柱，通过对提取液的选择、色谱条件的优化建立了一种简单、快速的鸡肉中3种四环素类抗生素的分析方法，该方法相对于目前国标方法具有仪器污染减少、基质干扰少、适用性强等特点，操作简单，结果准确，重现性好。