9种夹竹桃科和大戟科植物抗菌和抗氧化活性测定

张伟豪 翁道玥 宋慧云 崔泽华 孙坚 吴玉婷 单体江

摘要：【目的】筛选具有抗菌和抗氧化活性的植物次生代谢产物，为夹竹桃科和大戟科植物资源的开发和利用提供理论依据。【方法】以华南地区常见的5种夹竹桃科植物和4种大戟科植物为研究对象，采用甲醇冷浸提取和乙酸乙酯萃取方法制备植物提取物，以薄层层析（TLC）一生物自显影法测定9种植物提取物的体外抗细菌和抗氧化活性，通过斑点及斑点的迁移率（R_f）初步评价样品中化合物的极性和活性，根据抑菌斑大小评价化合物的活性。【结果】除银柴外，其余8种植物提取物对供试细菌均表现出一定的抑制活性，其中红背桂、红背山麻杆和蝴蝶果对7种供试细菌均表现出较强的抑菌活性，且红背桂和蝴蝶果提取物的抑菌斑直径超过10mm，R_f集中在0～0.13，说明活性化合物极性偏大。除夹竹桃科的羊角坳外，其余8种植物提取物均表现出一定的抗氧化活性，其中红背山麻杆的抗氧化活性最强，风为0～0.52，抗氧化斑直径为5-10mm。【结论】TLC-生物自显影法能够快速检测和筛选具有抗菌和抗氧化活性的植物提取物。红背山麻杆、红背桂和蝴蝶果可作为抗细菌的候选植物资源利用，红背山麻杆可同时作为优良的抗氧化植物资源利用。

关键词：夹竹桃科；大戟科；抗菌活性；抗氧化活性；薄层层析（TLC）一生物自显影法

0引言

【研究意义】自然界中植物资源丰富，从植物中寻找生物活性物质一直是国内外研究的重点，也是药物研发的最佳来源。植物的各个部位如叶、树皮和花等均含有丰富的次生代谢产物，部分次生代谢产物具有优良的抗菌活性，尤其对一些耐药性细菌具有较强的拮抗活性，如生物碱类、糖苷类、萜类、黄酮类、鞣酸类、醌类和香豆素类等（Momin et al，2012；Srivastava et al，2014；Elisha et al，2017）。夹竹桃科和大戟科植物化学成分丰富，具有广泛的药理活性，若能从中筛选出具有抗细菌和抗氧化的活性成分，可为新型生物源药物的开发及夹竹桃科和大戟科植物资源的开发和利用打下基础。【前人研究进展】目前，针对夹竹桃科和大戟科植物的研究主要集中于医学和药理学方面。夹竹桃科植物含有丰富的三萜类、生物碱类和油脂类化学成分，夹竹桃科植物中的强心苷类化合物具有强心、毒性、抗肿瘤、作用中枢神经、利尿、灭螺等活性（姚元成等，2013；苗智等，2016）；大戟科植物大都含有具生理活性的二萜类、酯类和生物碱类成分（李同琴等，2003）；此外，夹竹桃科和大戟科植物具有很好的杀虫和驱蚊活性（Meisner et al，1981；Rahuman et al，2008）。夹竹桃科植物罗布麻原麻挥发油对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和大肠杆菌均具有较强的抑菌活性（Li et al，2012），从其乙醇提取物中分离鉴定得到槲皮素、山奈酚、异槲皮素和木犀草素等11种化合物（李明华，2011），其中的黄酮类化合物具有较强的抗氧化活性，而酚羟基是黄酮类化合物抗氧化作用的主要活性基因（陶笑等，2017）。刘韶松等（2014）研究发现，夹竹桃科植物非洲马铃果种子总生物碱对3种癌细胞表现出很强的抑制活性，且以正丁醇层提取物的抗氧化活性最强，IC₅₀为0.268±0.002 mg/mL（DPPH法）。陈芳芳等（2017）研究了两种大戟科植物小返魂和叶下株不同层析层的抗氧化活性，结果表明不同层析层的抗氧化活性与总多酚含量呈正相关。在本研究选取的9种植物中，对夹竹桃、鸡蛋花和红背山麻杆的研究相对较多，前人有对夹竹桃和枝叶化学成分分析和抗菌杀虫活性的研究（王万贤等，2006），以及鸡蛋花不同部位提取物对各种致病菌的抑菌活性（Baghel et al，2010；高则睿等，2012），对于红背山麻杆则进行了成分分析，并从叶中分离得到具有强氧化活性的奎宁酸类化合物（黄永林等，2015a，2015b）；但针对其他6种植物的研究较少，如羊角拗根的甲醇洗脱物具有一定的体外抑菌活性（程纹等，2013）；红背桂、酸叶胶藤和蝴蝶果3种植物的化学成分虽已阐明（朱向东等，2011；李东，2012；陈兵祥和王小玲，2015），但对于其生物活性报道较少；银柴目前已报道的研究主要集中在中药应用方面；Khan等（2003）发现糖胶树的叶、茎和根皮提取物对革兰氏阳、阴性细菌均有抑制作用；本课题组也曾对糖胶树花次生代谢产物及其抗细菌活性进行研究（张伟豪等，2017），但抗氧化活性未曾报道。【本研究切入点】目前对夹竹桃科和大戟科植物抗细菌和抗氧化活性尤其是对植物病原菌抑制活性的研究报道较少。【拟解决的关键问题】以华南地区常见的5种夹竹桃科植物和4种大戟科植物为研究对象，采用薄层层析（TLC）一生物自显影法测定9种植物提取物的体外抗细菌和抗氧化活性，筛选具有开发和利用价值的植物提取物，为抗细菌和抗氧化活性化合物的分离提供候选植物。

1材料与方法

1.1试验材料

供试植物：供试植物详见表1，采自广东省广州市天河区华南农业大学（华农）和广州市火炉山森林公园（火炉山），标本由华南农业大学林学与风景园林学院郑明轩老师鉴定。

供试细菌：黄瓜角斑病菌、大肠杆菌、根癌土壤杆菌、番茄疮痂病菌、桉树青枯病菌、枯草芽孢杆菌和溶血葡萄球菌，均由华南农业大学林学与风景园林学院森林保护教研室提供。

仪器和试剂：旋转蒸发仪（东京理化器械株式会社），电子称（美国双杰电子科技有限公司），三洋高压灭菌锅（松下电器产业株式会社），三用紫外仪（上海安亭科学仪器厂），海爾医用冷藏箱（海尔生物医疗有限公司），超净工作台（苏州净化设备有限公司），移液器（Eppendorf生命科技公司）。甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷和无水乙醇均为分析纯（天津市富宇精细化工有限公司），硫酸链霉素（美国Sigrna公司），LB培养基（广东环凯微生物科技有限公司），噻唑蓝[3-（4，5-Dimethylthiazol-2-y1）-2，5-diphenyl tetrazoli-um bromide，MTT，美国Sigma-Aldrich集团公司]，2，2'-二.苯基-1-硝基苯肼（2，2'-Diphenyl-1-picryhydra-zyl，DPPH，美国Sigma-Aldricb集团公司），薄层层析硅胶（青岛海洋化工厂分厂）。

1.2植物提取物制备

采用甲醇冷浸提取法制备植物提取物：将采集的植物材料剪碎后分别装入三角瓶中，加入甲醇冷浸提取3次，每次7d。浓缩提取液，以水混悬后用等体积的乙酸乙酯萃取3次，浓缩乙酸乙酯萃取液即得到各植物的乙酸乙酯层提取物，将其转入西林瓶中，4℃冷藏备用。

1.3抗细菌活性测定

各植物提取物对供试细菌抗菌活性的测定采用伍慧雄等（2016）的TLC-MTT-生物自显影法，通过薄层层析板上抗菌斑点迁移率（R_t）初步评价样品中抗菌化合物的极性，根据抗菌斑点大小初步评价化合物的活性。薄层层析后在薄层板的一侧原点处点5μL硫酸链霉素（0.2 mg/mL）作阳性对照，所有试验相同条件重复3次，取平均值。

1.4抗氧化活性测定

采用TLC-DPPH-生物自显影法测定各植物提取物的抗氧化活性（古扎力努尔·艾尔肯等，2016），根据本研究中化合物性质薄层层析条件略有改进。使用二氯甲烷和甲醇（v/v=10：1）为展开剂进行薄层层析，待溶剂挥发后，喷洒0.1%DPPH乙醇溶液显色，1-2 min后即可观察。具有抗氧化活性的区域呈荧光黄色，不具有抗氧化活性的区域为原色。通过抗氧化活性化合物的R_t