高效液相色谱法测定米酒中有机酸的含量

杨成聪，沈馨，马雪伟，杨梦丽，董蕴，郭壮，*

（1.湖北文理学院食品科学技术学院鄂西北传统发酵食品研究所，湖北襄阳441053；2.襄阳出入境检验检疫局综合实验室，湖北襄阳441003）

作为一种酸甜适口的传统发酵食品，米酒通常以糯米为主要原料，接入酒曲发酵而成[1]。米酒中的有机酸包括草酸、乙酸、乳酸、苹果酸、琥珀酸、柠檬酸和酒石酸等，其通常由微生物发酵或后期添加形成[2]。适量的酸可以在米酒中起到调节和缓冲诸味的作用，但当酸度过高或过低时，均会造成米酒品质下降[3]。由此可见，有机酸作为米酒中重要的呈味物质，对米酒产品的滋味品质有着较大的影响，因而明确米酒中有机酸的种类及含量是极为必要的。

除酸碱滴定法外[4]，研究人员亦可以采用旋光法[5]、气相色谱法（Gas Chromatography，GC）[6]和高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）[7]对米酒中的有机酸含量进行测定。值得一提的是，虽然旋光法和酸碱滴定法较为经济，但其准确度较低，重复性亦较差[8]。此外，因有机酸具有较高的沸点，不容易气化，因而在使用气相色谱法对其测定时，需先对检测物进行衍生，方法较为复杂[9]。高效液相色谱法具有方法简便快捷、分离度高、结果准确和对所测组分沸点没有要求等优点，因而广泛的应用于食品中有机酸的测定[10]。GB 5009.157-2016《食品安全国家标准食品有机酸的测定》采用该方法约束了果汁饮料及果汁、果味碳酸饮料、果冻、水果罐头、胶基糖果、固体饮料、面包、饼干、糕点、烘焙食品馅料和生湿面制品中有机酸的测试方法。然而令人遗憾的是，米酒并不在上述约束范围内。

本研究采用HPLC法对米酒中草酸、乙酸、乳酸、苹果酸、琥珀酸、柠檬酸和酒石酸含量进行了测定，通过色谱条件的优化和方法性能的评价，实现了米酒中7种有机酸的快速分离和定量分析，为米酒生产厂家产品的自我检测提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

米酒：市售；草酸、乙酸、乳酸、苹果酸、琥珀酸、柠檬酸和酒石酸标准品：西陇科学股份有限公司；磷酸二氢钾、磷酸氢二铵和磷酸（均为分析纯）：天津市北辰方正试剂厂；甲醇和异丙醇（均为色谱纯）：国药集团化学试剂有限公司；0.45 μm微孔滤膜：上海半岛实业有限公司净化器材厂。

LC-20ADXR高效液相色谱仪（配置有SIL-20A XR自动进样器、LC-20AD XR四元低压梯度泵、CTO-10AS vp柱温箱、SPD-M20A二极管阵列紫外-可见光检测器）、Inertsil ODS-SP C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）：日本岛津公司；PGJ-10-AS 品冠纯水机：武汉品冠仪器设备有限公司；2-6E小型台式离心机：德国Sigma实验室离心机股份有限公司；PHS-25型数显pH计：上海仪电科学仪器有限公司；HHS-2数显恒温水浴锅：长丰仪器设备厂；PS-100A超声波清洗机：深圳市洁汇超声洗净设备有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品的处理方法

用天平称取20.00 g试样置于培养皿中，然后转移至研钵中磨至粉碎，之后转移至100 mL的容量瓶中，用流动相定容后静置一段时间。将定容后的样品转移至离心杯中，12 000 r/min离心10 min，取上清液过0.45 μm微孔纤维素滤膜，滤液备用。

1.2.2 色谱条件的优化

1.2.2.1 供试样品的制备

分别称取草酸0.15g、苹果酸0.30 g、柠檬酸0.60 g、酒石酸0.75 g以及乳酸、醋酸和琥珀酸各1.50 g溶解后于50 mL的容量瓶中定容，制成母液待用。

分别取各母液1.0 mL，再加入0.2 mL 1.0 mol/L的磷酸，用超纯水定容至10 mL，混匀后作为供试样品待用。

1.2.2.2 流动相中磷酸盐的选择

流动相：分别配制浓度均为0.01 mol/L的磷酸二氢钾和磷酸氢二铵溶液，流动相中不添加乙腈，调节pH 值为 2.30；进样量：20 μL；检测器：SPD-M20A；色谱柱：InertsilODS-SPC18 色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：30℃；流速：0.8 mL/min；检测波长：215 nm。

1.2.2.3 流动相中磷酸盐浓度选择

流动相：分别配制0.01、0.05 mol/L和0.08 mol/L的磷酸二氢钾溶液，流动相中不添加乙腈，调节pH值为 2.30；进样量：20 μL；检测器：SPD-M20A；色谱柱：InertsilODS-SPC18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：30℃；流速：0.8 mL/min；检测波长：215 nm。

1.2.2.4 流动相pH值的选择

流动相：分别配制pH值为2.30、2.50和2.90，浓度为0.01 mol/L的磷酸二氢钾溶液，流动相中不添加乙腈；进样量：20 μL；检测器：SPD-M20A；色谱柱：In ertsilODS-SPC18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：30℃；流速：0.8 mL/min；检测波长：215 nm。

1.2.2.5 流动相中乙腈比例的选择

流动相：浓度为0.01 mol/L的磷酸二氢钾溶液，分别设置乙腈和水相的体积比为0∶100、5∶95和10∶90；调节pH值为2.30；进样量：20 μL；检测器：SPDM20A；色谱柱：InertsilODS-SPC18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：30 ℃；流速：0.8 mL/min；检测波长：215 nm。

1.2.2.6 柱温的选择

分别设置柱温为 25、30、35、40 ℃，流动相：浓度为0.01 mol/L的磷酸二氢钾溶液，流动相中不添加乙腈，调节pH值为 2.30；进样量：20 μL；检测器：SPD-M20A；色谱柱：InertsilODS-SPC18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：0.8 mL/min；检测波长：215 nm。

1.2.2.7 流速的选择

分别设置流动相流速为0.5、0.8、1.0 mL/min和1.2 mL/min；流动相：浓度为0.01 mol/L的磷酸二氢钾溶液，流动相中不添加乙腈，调节pH值为2.30；柱温为 25 ℃；进样量：20 μL；检测器：SPD-M20A；色谱柱：InertsilODS-SPC18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；检测波长：215 nm。

1.2.3 米酒中7种有机酸的测定

1.2.3.1 米酒样品的采集

从襄阳市武商广场购物中心购买10种品名的米酒样品，依次编号为MJ1～MJ10。

1.2.3.2 标准曲线的制作

分别称取草酸0.15 g、苹果酸0.30 g、柠檬酸0.60 g、酒石酸0.75 g以及乳酸、醋酸和琥珀酸各1.50 g分别溶解后于50 mL的容量瓶中定容，制成母液待用。分别吸取 0.1、0.2、0.5、1.0、1.4 mL，在加入 0.2 mL 1.0 mol/L 磷酸后，用流动相定容至10 mL。分别配制各个梯度的标准品溶液，溶液过0.45 μm滤膜待用。每个浓度重复进样，分别以7种有机酸的浓度为自变量x，色谱峰面积的均值为因变量y，采用外标法进行标准曲线计算。

色谱条件：流动相：浓度为0.01 mol/L的磷酸二氢钾溶液，流动相中不添加乙腈，调节pH值为2.30；进样量：20 μL；检测器：SPD-M20A；色谱柱：InertsilODSSPC18 色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：25℃；流速：1.0 mL/min；检测波长：215 nm。

1.2.3.3 结果计算

米酒样品中的有机酸含量按照以下公式进行计算：

式中：X为样品中有机酸的含量，g/kg；C为由标准曲线求得样品中某有机酸的浓度，μg/mL；V为样品的最后定容体积，mL；m为样品质量，g。

1.2.3.4 米酒中7种有机酸含量的测定

所有的试样均按照1.2.1中的处理方法进行处理，按照1.2.3.2中的色谱条件进行测定，按照1.2.3.3中的计算方法进行计算。

1.2.4 方法性能评价

1.2.4.1 重复性试验

取MJ5样品2 mL于10 mL容量瓶中，加入0.2 mL 1 mol/L磷酸后定容。12 000 r/min离心10 min，上清液过0.45 μm滤膜后，按照1.2.3.1中的色谱条件进行7种有机酸峰面积的测定，试验重复5次，同时对其相对标准偏差值（relative standard deviation，RSD）进行计算。

1.2.4.2 精密度试验

将1.2.2.1中的供试样品，不间断进样5次，色谱条件同1.2.3.2，分别对7种有机酸的峰面积进行测定，同时对其相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）进行计算。

1.2.4.3 加标回收率试验

取MJ5样品2 mL于10 mL容量瓶中，加入0.2 mL 1 mol/L磷酸后定容。12 000 r/min离心10 min，上清液过0.45 μm滤膜备用。滤液分为4份，1份不做任何处理，另外3份添加一定量的7种有机酸的混合溶液。色谱条件同1.2.3.2。

1.2.5 统计分析

使用岛津高效液相色谱自带软件Labsolution将色谱图转化为数据矩阵后，利用Origin 8.5软件（O－riginLab，MA，USA）作图。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 流动相中磷酸盐种类的选择

在色谱柱为Inertsil ODS-SP C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm），柱温为 30℃，流动相流速为0.8mL/min，pH值为2.30，流动相中不添加乙腈，磷酸盐浓度为0.01 mol/L的固定条件下，分别选择磷酸二氢钾和磷酸氢二铵作为流动相中的磷酸盐，探讨了磷酸盐种类对7种有机酸分离效果的影响，其结果如图1所示。

由图1可知，磷酸二氢钾和磷酸氢二铵对7种有机酸分离效果的影响不大，但当缓冲盐的种类选择磷酸二氢钾时，其基线要比磷酸氢二铵更平整，且噪音较小。综上所述，本研究选择磷酸二氢钾作为流动相中的缓冲盐。

2.1.2 流动相中磷酸盐浓度选择

在色谱柱为Inertsil ODS-SP C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm），柱温为 30℃，流动相流速为0.8mL/min，pH值为2.30，流动相中不添加乙腈的固定条件下，分别配制磷酸二氢钾的浓度为0.01、0.05、0.08mol/L，探讨了磷酸二氢钾浓度对7种有机酸分离效果的影响，其结果如图2所示。

由图2可知，磷酸盐的浓度对7种有机酸的保留时间没有较大的影响，但较高的盐浓度会对色谱柱和整个流路系统造成损害，因此在其分离效果相同的条件下选择磷酸二氢钾的浓度为0.01 mol/L。

图1 流动相磷酸盐种类对7种有机酸分离效果的影响Fig.1 Effect of phosphate type of mobile phase on the separation of 7 kinds organic acids

图2 流动相磷酸二氢钾浓度对7种有机酸分离效果的影响Fig.2 Effect of monopotassium phosphate concentration in mobile phase on the separation of 7 kinds organic acids

2.1.3 流动相pH值的选择

在色谱柱为Inertsil ODS-SP C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm），柱温为30℃，流动相流速为0.8mL/min，流动相中不添加乙腈，磷酸二氢钾浓度为0.01 mol/L的固定条件下，分别设置流动相的pH值为2.30、2.50和2.90，探讨了流动相pH值对7种有机酸分离效果的影响，其结果如图3所示。

由图3可知，流动相的pH值会对7种有机酸的保留时间造成影响，当pH值为2.30时7种有机酸均可被较好的分离，但当pH值为2.50或2.90时，草酸和酒石酸的峰均不能很好的分开。值得一提的是，随着流动相pH值的升高，部分有机酸的出峰时间出现缩短的情况。综上所述，本研究选择流动相pH值为2.30。

2.1.4 流动相中乙腈比例的选择

在色谱柱为Inertsil ODS-SP C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm），柱温为30℃，流动相流速为0.8mL/min，pH值为2.30，磷酸二氢钾浓度为0.01 mol/L，分别设置乙腈与缓冲盐溶液的体积比为0∶100、5∶95和10∶90，探讨了流动相中乙腈比例对7种有机酸分离效果的影响，其结果如图4所示。

由图4可知，随着乙腈体积比例的增加，各个有机酸的保留时间均相应缩短，当乙腈与缓冲盐溶液的体积比是5∶95时，草酸、酒石酸、乳酸和乙酸均不能达到基线分离，当乙腈与缓冲盐溶液的体积比是10∶90时，7种有机酸均不能达到基线分离。综上所述，本研究选择流动相中不添加乙腈。

图3 流动相pH值对7种有机酸分离效果的影响Fig.3 Effect of pH of mobile phase on the separation of 7 kinds organic acids

图4 流动相中乙腈比例对7种有机酸分离效果的影响Fig.4 The effect of acetonitrile percentage in mobile phase on the separation of 7 kinds organic acids

2.1.5 柱温的选择

在色谱柱为Inertsil ODS-SP C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm），流动相流速为0.8mL/min，pH值为2.30，流动相中不添加乙腈，磷酸二氢钾浓度为0.01 mol/L的固定条件下，分别设置柱温为25、30℃和35℃，探讨了柱温对7种有机酸分离效果的影响，其结果如图5所示。

由图5可知，柱温的改变对7种有机酸分离效果的影响并不大，但随着温度的升高，色谱柱损伤亦随之增大。综上所述，本试验最后选择的柱温为25℃。

2.1.6 流动相流速的选择

在色谱柱为Inertsil ODS-SP C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），柱温为 25 ℃，pH 值为 2.30，流动相中不添加乙腈，磷酸二氢钾浓度为0.01 mol/L的固定条件下，分别设置流速 0.5、0.8、1.0、1.2 mL/min，探讨了流动相流速对7种有机酸分离效果的影响，其结果如图6所示。

由图6可知，随着流速的增加，有机酸的保留时间随之提前。在保证分离效果和压力适中的前提下，应尽可能快的使待检测组分被检出，进而达到缩短检测时间的目的。综上所述，本试验最后选择的流动相流速为1.0 mL/min。

图5 柱温对7种有机酸分离效果的影响Fig.5 Effect of column temperature on the separation of 7 kinds organic acids

图6 流动相流速对7种有机酸分离效果的影响Fig.6 Effect of flow rate of mobile phase on the separation of 7 kinds organic acids

2.2 米酒中7种有机酸含量的测定

2.2.1 标准回归方程

按照1.2.3.2中方法，分别以草酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸7种有机酸的浓度为自变量x，色谱峰面积为因变量y，进行标准曲线回归方程的计算，结果如表1。

由表1可知，7种有机酸线性回归方程的相关系数均在0.9960以上。由此可见，各有机酸的浓度和峰面积之间具有良好的线性关系，这亦可间接证明本研究所采用的色谱条件可以实现米酒样品中7种有机酸的精确定量。

表1 7种有机酸的回归方程Table 1 Linear regression equations of detection for 7 kinds organic acids

2.2.2 米酒中7种有机酸含量的测定

取2 mL样品加入0.2 mL 1 mol/L磷酸后，用流动相定容，12 000 r/min离心10 min后，上清液过0.45 μm滤膜后上机，按照1.2.3.2中的色谱条件对米酒中7种有机酸的含量进行测定，结果如表2所示。

2.3 方法性能研究

2.3.1 重复性试验结果

按照1.2.1制作MJ5米酒样品5份，5份样品分别进样，色谱条件同1.2.3.2，测定样品中7种有机酸的含量，同时计算RSD。结果如表3所示。

表2 10个米酒样品中7种有机酸的含量（n=3）Table 2 Contents of 7 kinds organic acids in 10 rice wine samples（n=3）

表3 重复性试验Table 3 Result of repetitive test

由表3可知，7种有机酸的RSD值均在1.0%以下，由此可知，本试验所采用的研究方法在测定上述7种有机酸时具有良好的重复性。

2.3.2 精密度试验结果

准确吸取1.2.2.1节中7种有机酸的混合供试溶液，按照1.2.3.2节中的色谱条件进行测定，不间断进样5次，分别测量7种有机酸的峰面积和相对标准偏差值，其结果如表4。

由表4可知，7种有机酸的RSD值均在1.0%以下，由此可知，本试验具有较好的精密性，可以满足试验要求。

表4 精密度试验结果Table 4 Results of precision test

2.3.3 加标回收率试验结果

按照1.2.4.3的样品处理方法制作MJ5米酒供试样品，同时按1.2.3.2中的色谱条件对样品中7种有机酸的含量进行测定，其含量和加样回收率结果如表5所示。

表5 加样回收率试验结果Table 5 Results of spike recovery test

由表5可知，7种有机酸的平均回收率在98.74%和101.00%之间，由此可见，HPLC法对米酒中7种有机酸含量测定时回收率较高，在试验允许的范围内，可以很好的满足定量分析的要求。

3 结论

本研究建立了高效液相色谱法测定米酒中草酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸7种有机酸的方法，其中检测器为二极管阵列紫外-可见光检测器，检测波长215 nm，Inertsil ODS-SP C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），柱温为 25℃，流动相为0.01 mol/L的磷酸二氢钾溶液，pH值为2.30，流速为1.0 mL/min。

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