猪弓形虫感染的血清肽谱诊断法建立及初步应用

郝福星， 左伟勇， 刘 莉，2

(1.江苏农牧科技职业学院/江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室，江苏泰州 225300； 2.扬州大学兽医学院，江苏扬州 225009)

弓形虫病是由刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)引起的一种人兽共患寄生虫病，宿主种类十分广泛[1]。猫科动物是弓形虫的终末宿主[2]，在猫体内弓形虫进行有性生殖产生卵囊，卵囊随猫的粪便排出体外，并发育成具有感染性的孢子化卵囊，后者能够感染人和大多数的温血动物。人因与动物接触、误食了受弓形虫卵囊污染的水源、土壤或食物(肉、蛋)，会引起弓形虫感染[3]。据文献报道，人和动物感染呈世界范围内分布，人群的平均感染率25%～50%，多呈隐性感染，推算全世界约1/4的人感染弓形虫[4]；感染弓形虫的动物种类很多，如家畜、家禽、鼠以及鱼类，可引起猪、牛、羊、犬、鸡等畜禽发病，可引起大批发病，死亡率高，给畜牧业生产造成严重经济损失[5-7]。而猪作为人类最主要的肉产品来源之一，检测其弓形虫感染状况，在公共卫生与食品安全方面意义重大[7]。因此，开展猪弓形虫病的研究工作，对畜牧业发展和人类健康具有重要的经济价值和社会意义。

弓形虫感染的诊断主要包括病原学检测、免疫学诊断及分子生物学诊断技术[8]。病原学检测方法有直接涂片与组织切片染色法，该法可对弓形虫急性感染进行确诊，但存在费时费力的缺点，对弓形虫隐性感染的检测效能不强；动物接种试验和细胞培养法能够直接确认病原体存在，但敏感性低、耗时、易漏诊且难以应用于实际操作。以间接血凝试验(IHA)与酶联免疫吸附试验(ELISA)为主的免疫学诊断方法[9]具有特异性强、敏感性高、操作简便等优点，是弓形虫病流行病学调查和诊断最常用的方法，但有报道显示，临床诊断中也存在假阳性，需要与其他诊断方法综合判定[10]。以PCR为主的分子生物学诊断技术[11]具有灵敏度高的特点，但是因检测样本(如外周血)复杂与PCR技术本身等原因也存在假阳性高、准确性较差等缺点。因此，迫切需要建立一种准确性好、快速灵敏的检测方法。

笔者利用MALDI-TOF质谱结合ClinProTool分析在小鼠动物模型上已能成功对弓形虫感染进行判定[12]。有文献显示，该方法在包括血吸虫感染、肿瘤、神经系统疾病诊断中也有较广泛的应用[13]，具有高通量、灵敏度高、可重复性好及样本需求量少等优势，本研究拟建立一种快速准确诊断猪弓形虫感染的方法，对江苏泰州部分地区猪场的弓形虫感染情况做一调查，为当地猪的养殖与防病提供重要的参考。

1 材料与方法

1.1 受试动物与试剂

江苏省泰州市辖区(海陵、高港、姜堰)小型猪场(<100头猪)育肥猪，共采集3个猪场，每个猪场采集50头。

弓形虫间接血凝试验冻干抗原(IHA抗原，批号：20151011)；标准阳性血清、标准阴性血清、稀释液(批号：20151011)，均购自中国农业科学院兰州兽医研究所。MB-WCX磁珠纯化试剂盒(美国Bruker Daltonic公司)，丙酮、甲醇、异丙醇、乙腈、三氟乙酸、甲酸等均为色谱纯级。基质：HCCA(α-氰-4-羟肉桂酸)，300 mg/L，溶于乙醇 ∶丙酮=2 ∶1，新鲜配制。

1.2 血清采集与分离

每头猪行耳静脉采血2～2.5 mL，将采集的新鲜血液，加入1.5 mL无菌EP管中，即刻置于4 ℃冰箱保存，待30 min后以12 000 r/min、4 ℃离心10 min，分离血清冷冻于-80 ℃冰箱待测。

1.3 弓形虫IHA诊断方法

按照试剂说明书进行操作，即于96孔有机玻璃板加入75 μL稀释液，每个待检血清样品加稀释液4孔，取25 μL血清加入第一孔，混匀后吸取25 μL加入第二孔，以此类推，进行倍比稀释。待检血清加完后，每孔加入25 μL诊断液，将反应板放至微量振荡器上振荡1～2 min，静置于22～37 ℃恒温箱中作用2～3 h后观察结果。每批次均需设阳性对照与阴性对照。

1.4 血清肽质谱检测法

根据磁珠纯化血清多肽试剂盒标准操作规程，将10 μL样本结合液与10 μL磁珠试剂混合，与血清样本10 μL混匀并室温静置5 min；将磁珠进行富集并弃上清，清洗磁珠后加洗脱液(ES)5 μL与磁珠混匀，室温静置5 min后置磁珠富集器并弃上清，最后加5 μL稳定液(SS)至离心管并混匀，取 1 μL 与基质10 μL完全混合，制成混悬液，取1 μL混悬液点靶，室温干燥后上机检测，设置MALDI-TOF-MS仪器参数，选择LP-Clinprot.pa方法，靶MTP_polished steel 384，激光能量在40%左右，检测分子量范围为m/z800～12 000；应用flexanalysis与Clin ProTools软件对采集图谱进行分析，应用MASCOT数据库对差异多肽峰进行初步搜库鉴定。

2 结果与分析

2.1 血清间接血凝试验结果

根据IHA阳性结果标准，在阳性对照血清效价不低于 1 ∶1 024，阴性对照孔血清除第1孔允许有前滞现象“+”外，其余各孔及对照孔均为“?”的前提下，对被检血清进行判定，被检血清抗体效价达到或超过1 ∶64为阳性。结果显示，本研究采集的泰州市辖区(海陵、高港、姜堰)3个小型猪场的150头份血清样本中阳性血清为25份，阳性率为16.67%(表1)。

表1 泰州部分地区猪弓形虫感染情况调查(IHA法)

2.2 血清多肽指纹图谱分析

将25份IHA阳性血清与125份阴性血清分别归为感染组与对照组，利用磁珠纯化血清多肽，并与基质混匀后点靶进行质谱检测。结果显示，与阴性对照组相比，IHA阳性组猪血清中在m/z1 608.59、1 971.84、5 004.01、4 617.49、7 808.23的5个多肽峰的表达显著上调，而m/z1 233.01、8 007.66、2 356.37、3 735.65的4个峰呈显著下调(表2)。

表2 猪弓形虫感染组与对照组血清差异表达多肽(ClinProTool法)

注：“*”表达上调，“**”表达下调。

2.3 弓形虫检测方法的建立与验证

将血清多肽指纹图谱导入Clin ProTools软件，并将IHA阳性血清与阴性血清进行分组，寻找并依据组间谱图差异，建立猪的弓形虫感染诊断方法，为验证诊断方法的敏感性与特异性，将阳性与阴性血清指纹图谱导入，质谱可自动化判定，结果显示，25份IHA阳性血清可以成功被质谱诊断模型判定为弓形虫感染，敏感性达100%，而125份阴性血清中有119份可被判定为未感染，准确性达95.2%(119/125)，另6份不能判定。

3 结论与讨论

猪弓形虫病呈世界范围流行，我国分布十分广泛，食入猫粪便中的卵囊、通过损伤的黏膜与皮肤、母猪孕期经胎盘感染仔猪，均为本病的感染途径[14]。规模化、现代化的养殖方式虽可以避免传统粗放养殖中的寄生虫感染情况，如疥螨和蛔虫等感染率得以大大降低，但畜牧场外部环境、猪群内部引进和繁殖等一系列环节的存在，使得弓形虫仍然有较高的感染机会，甚至呈暴发流行[15]，而弓形虫作为人兽共患寄生虫病，禽、犬、猫等多种动物均可携带[16]，对公共卫生威胁更大，有必要对该病进行重点防控。有报道显示，部分猪场发病率可高达60%以上[17]，病死率可高达64%。随着养殖水平提高，该病在我国多呈隐性感染，一旦疏于防范，有可能造成弓形虫病的流行和暴发，因此，对规模化养殖猪场尤其要加强该病的监测。相比传统的检测方法，血清多肽指纹图谱检测法具有高通量、检测效率高的优势，且在实验小鼠[18]、家兔[19]等动物已成功建立了寄生虫病的诊断方法，在猪的弓形虫感染诊断中，还较少见报道。

MALDI-TOF质谱结合Clin ProTools软件分析，可以将弓形虫感染与未感染猪血清中的多肽进行区别，并以血清差异表达多肽建立诊断方法，对该方法的验证结果显示，与传统的IHA方法一致，可以用于猪感染弓形虫的诊断与早期筛查。本研究采用的质谱检测法，可以在30～60 min内实现384个样本的检测，具有高通量、快速、自动化程度高等特点，且血清样本需求量为传统IHA实验的1/20，很大程度上减少受试猪的失血量。对血清差异表达多肽的检测与MASCOT搜库分析显示，与笔者之前的研究比较，m/z1 971.84、5 004.01 同样出现在弓形虫感染的小鼠与本研究选取的IHA阳性猪血清中，经二级质谱鉴定，该2种多肽分子可能为弓形虫表面膜蛋白的片段，有望成为弓形虫感染动物的指征性分子。ClinProTools分析显示，利用猪血清中9个差异性多肽峰建立诊断方法，其敏感性与准确性较高，该方法以多个差异多肽作为判断指标，其准确性要优于单一指标，且血清多肽检测方法是建立在群体基础上，更好地规避了个体差异，在同组血清样本中能够最大限度地体现共性，可重复性强。因此，该方法有望成为判定猪弓形虫感染状况的辅助筛查手段。

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