干旱胁迫对白刺花根尖细胞有丝分裂的影响

吴丽芳， 魏晓梅， 尹 辉， 颜岳辉， 李 通

(1.曲靖师范学院生物资源与食品工程学院，云南曲靖 655011；2.云南省高校云贵高原动植物多样性及生态适应性进化重点实验室，云南曲靖 655011)

种子是有性繁殖植物的重要繁殖器官，种子能否顺利萌发及萌发初期长势直接影响到幼苗的建成、存活、竞争和个体未来的适合度。而植物种子萌发、生长发育有赖于细胞数目的增加和细胞体积的扩大，细胞数目的增加主要通过细胞分裂来实现，如果细胞分裂周期过程中遇到不利的逆境，将直接影响到植物整个生命周期活动，这一过程中，又以早期萌发生长期最具典型和敏感性。

白刺花(Sophoradavidii)属豆科槐属落叶灌木，在我国主要分布在云南、四川、陕西、甘肃、山西、河北、河南、湖北、湖南、江苏、浙江等地，具深根性、抗旱强等特点，是集药用、食用、饲料、蜜源、水土保持、改良土壤、生态修复为一体的喀斯特山地优良野生植物。云贵高原属于典型的喀斯特地区，该区域石漠化现象日趋严重，且连年干旱的气候促使生态系统岌岌可危。云南自2009—2012年出现了史无前例的旱情，且今后干旱环境将一直存在，给生态治理提出了严峻地考验，从自然界中筛选抗旱植物，用于土壤、生态退化修复已收到了事半功倍的成效。干旱胁迫将导致植物一系列的连锁反应，从对逆境的感知、传导、转录因子控制到生理反应和形态结构的改变，最终影响到植物的生长发育。目前已对白刺花抗旱性进行了多方面的研究，王慧慧等研究了干旱胁迫下白刺花种子大小与种子萌发的关系[1]；邵莉研究了白刺花干旱胁迫下生理相应机制及克隆了P5CS、DREB、DHN3个与抗旱相关的基因[2]；王海珍等研究了白刺花适应干旱的生理机理[3]；王红梅等研究了干旱胁迫下白刺花幼苗的生理生化变化[4]；吴福忠等通过施用外源氮研究了干旱河谷白刺花幼苗生长、生物量及碳、氮、磷积累与分配的关系[5]；李芳兰等研究了干旱胁迫下白刺花的形态和生理变化[6]。从现有资料来看，多数研究主要围绕干旱环境下白刺花种子萌发、幼苗生长过程的形态及生理生化变化以及在分子水平上相关抗旱基因的克隆，而对于从细胞分裂基础研究干旱胁迫下的遗传损伤少见报道。基于此，本试验在模拟干旱环境下，研究幼苗萌发过程中短期的干旱胁迫对白刺花根尖细胞染色体的分裂、结构变化，为进一步开展抗逆生境的基础研究提供更多的数据资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料于2014年10月在曲靖师范学院校园里采集，脱去外壳剔除有虫害的种子后，实验室自然风干保存于4 ℃冰箱中备用。

1.2 萌发试验

将健康饱满的种子用刀片划破种皮后，用10%次氯酸钠消毒20 min，无菌水冲洗4～6次后放入培养皿中发芽，发芽温度27 ℃，黑暗培养。

1.3 干旱胁迫处理

待白刺花种子萌发至根尖长1～2 cm时，于08：00分别用0%、10%、20%、30%、40%、50%聚乙二醇(PEG-6000)胁迫处理6、12、24、48 h，每处理胁迫50颗小苗，胁迫完成后，迅速用蒸馏水涮洗根尖并将根尖取下，4 ℃冰箱低温预处理24 h，放到卡诺固定液中固定24 h，之后转入70%乙醇于4 ℃冰箱中保存备用。

1.4 有丝分裂染色体制片

染色体制片参照李懋学的方法[7]。将准备好的材料置于0.1 mol/L HCl中，60 ℃水浴解离10～15 min直至根尖软化，用蒸馏水漂洗3～5次后，吸水纸吸干，放在载玻片上，用刀片剔除根尖最顶端根冠后，截取少许根尖分生区，用解剖针将其捣碎并均匀地涂开，滴1～2滴卡宝品红染液，染色2～3 min，盖上盖玻片，用铅笔轻敲并用吸水纸吸干水分，酒精灯火焰上轻轻烘烤，以利于细胞分散。

1.5 镜检及观察统计

将制备好的装片置于显微镜的载物台上，先在低倍镜(10×10)下找到分生组织区细胞分散均匀、分裂相较多的区域，再到高倍镜(10×40)下观察。每处理的根尖至少观察10个装片，每个装片在高倍镜下观察和统计10个视野，记录每个视野中观察的总细胞数、分裂细胞数及各分裂相的比率。

1.6 干旱胁迫后观察根尖细胞有丝分裂、微核、染色体畸变指标

测定计算的指标参照周锦雯的方法[8]。有丝分裂指数=处于分裂期的细胞数/总细胞数×100%；有丝分裂指数下降速度=-(有丝分裂指数T-有丝分裂指数t)/有丝分裂指数t×100%；染色体畸变率=染色体畸变细胞数/分裂细胞数×100%。其中，有丝分裂指数T表示处理时的有丝分裂指数；有丝分裂指数t表示同一时间处理下对照组的有丝分裂指数。微核率(micronucleus frequency，简称MNF)是指1 000个细胞中微核细胞数所占的比例。

1.7 数据分析

试验数据用Excel和DYES软件进行处理，单因素随机区组试验进行方差分析，LSR法检验各处理间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 干旱胁迫对白刺花根尖细胞有丝分裂的影响

由表1可知，随着PEG-6000浓度的增加和处理时间的延长，白刺花根尖细胞有丝分裂表现出不同的差异。低浓度PEG-6000≤10%时，在处理6～12 h内，同一时间处理下与对照差异不显著；0～6 h短期处理下，对白刺花根尖细胞有丝分裂有一定的促进作用，有丝分裂指数从8.78%上升至 9.09%。随着胁迫浓度的增加，其浓度>10%后，有丝分裂细胞减少，表现出了一定的抑制效应。尤其当浓度达到50%时，胁迫6 h时的细胞分裂指数为3.14%，而当胁迫48 h后，有丝分裂指数仅1.96%，可以非常明显地观察到几乎所有细胞都已停止了分裂。结果表明，PEG-6000干旱胁迫对白刺花根尖细胞有丝分裂的影响不仅与处理时间有关，而且与处理浓度也有密切关系，是二者共同作用的结果。

注：同列数据后不同小写字母、大写字母分别表示在0.05、0.01水平上差异显著、极显著。表3、表4同。

植物根尖细胞分裂指数的大小反映了植物生长发育的状况，同时也反映出细胞分裂活性的高低。从表2中可以看出，随着处理时间的延长和处理浓度的增加，有丝分裂指数下降速率明显在上升。当处理时间为6 h、处理浓度10%时，有丝分裂指数下降速率为-3.53%；当浓度增加至50%，有丝分裂指数下降速率为64.24%；当处理时间为48 h、浓度为50%时，有丝分裂指数下降速率最大，为78.32%。从整个变化趋势来看，细胞有丝分裂能力随处理时间的延长和浓度的升高不断降低。

2.2 干旱胁迫对白刺花染色体畸变的影响

由表3可知，染色体畸变率高低与处理浓度和处理时间呈正相关。当处理时间为12 h、PEG-6000浓度≤10%时，与对照处理差异显著；当处理时间超过12 h，各浓度处理与对照差异极显著。当处理浓度>30%时，白刺花根尖细胞染色体畸变率均超过10%，尤其当浓度为50%、处理48 h时染色体畸变率高达16.05%。结果表明，染色体畸变率与处理时间、处理浓度均有关系。

表2 干旱胁迫对白刺花根尖细胞有丝分裂指数下降速率的影响

染色体畸变率往往通过多种类型而表现，在本试验中，可以观察到染色体断片、落后染色体、染色体桥、多极分裂、染色体浓缩等(图1至图7)。通过研究观察，染色体断片是最常见的畸变类型，染色体断片通常是由于在理化因素的作用下1个染色体发生1处或多处断裂而不重接且无着丝粒的节段，如果染色体丢失片段比较大，或丢失片段上载有控制性状的主基因，将会不可逆地导致细胞或生物体死亡。染色体桥是染色体发生断裂，带有着丝粒的2条染色体再经重接，当2个染色单体后期向两极分开，二者两臂仍粘连在一起所形成的。落后染色体的产生有2种，一种是细胞有丝分裂前中期，染色体不规则排列在赤道板上时，有个别染色体或染色体片断未能按时到达赤道板的位置；另一种是细胞有丝分裂后期，正常细胞的染色体都移向两极，而个别染色体或染色体片断滞留于两极之间，与染色体的主体部分移向两极的速度和进程不同而形成的。落后染色体经细胞分裂，可能随机趋向于细胞分裂的一极，也可能随细胞的分裂而丢失。

表3 干旱胁迫对白刺花根尖细胞染色体畸变率的影响

2.3 干旱胁迫对白刺花根尖细胞微核的影响

微核也是染色体畸变的一种形式，早期微核技术主要用于水质的检测方面。微核位于细胞质中，直径是主核的1/20至1/3，是完全与主核分开的圆形或椭圆形的小核。从表4可以看出，当PEG-6000浓度小于20%时，微核率在10‰以下；当PEG-6000浓度高于20%后，微核率均大于10‰，尤其当浓度达到50%时，处理48 h的微核率最高，达15.76‰。早期研究认为，微核仅出现在细胞分裂的间期，后来经过多年研究发现，细胞分裂的任何时期都能产生微核，且微核的大小与处理时间、处理浓度有关。本试验中也观察到不同分裂时期的微核(图8至图11)。

表4 干旱胁迫对白刺花根尖细胞微核的影响

3 讨论

PEG-6000作为一种渗透调节剂，它能模拟干旱逆境的原因是其可阻塞植物的输导组织。Kaufmann等研究得出，PEG-6000诱导水分逆境所取得的效果与土壤干旱是一样的，PEG-6000诱导下引起植物内源激素如ABA积累，而植物根部对ABA的反应最为敏感，从而导致植物生长受到抑制[9]。再者干旱胁迫下植物由于脱水使膜的构成或结构发生改变，导致质膜透性增加，细胞膜系统遭受破坏。在对小麦[10-11]、柑橘[12]、番茄[13]等研究中发现干旱胁迫下植物细胞破裂、内溶物溢出，多数叶绿体溶解散乱在基质中，细胞保护酶系统发生显著变化。在抑制植物生长方面，干旱胁迫可能降低与DNA合成有关的酶活性，致使DNA的合成速率减慢，细胞分裂的间期延长[14]。本研究也观察到，白刺花根尖细胞有丝分裂指数随着PEG-6000处理浓度升高和处理时间延长明显下降。短期(6 h)低浓度(PEG-6000浓度10%)有一个上升趋势，这可能是植物短期内适应环境变化的应激反应，使相当一定时期内代谢增强，细胞周期加快导致，而当植物自身应激反应超过防御保护屏障后，植物的生长发育就会受到影响，甚至死亡，从而导致细胞分裂能力降低。

染色体畸变是植物细胞有丝分裂过程中受到理化因素的影响，DNA或蛋白质的合成受到干扰，诸如纺锤体蛋白等与染色体运动有关的生物分子不能合成或合成量不足，或染色体损伤后不能及时正常修复而导致[15]，有染色体桥、染色体断片、细胞多极化等畸变类型。本研究中，PEG-6000浓度 0～20%、处理24 h内时，白刺花根尖细胞染色体畸变率在10%以下，当浓度大于30%时，染色体畸变率均在10%以上。本试验中，观察到了染色体断片、染色体桥、染色体多极化、染色体浓缩等多种类型的畸变，其中染色体断片是主要的畸变类型。染色体浓缩可能是长时干旱胁迫致使细胞合成代谢受阻，抑制微管蛋白的组装，抑制调控细胞分裂的各种酶类的活性，使染色体被原位抑制而缩短变粗导致的。如在某些热击研究中，细胞在热激处理下合成热激蛋白，而热激也可能导致染色体的快速浓缩。

微核是染色体畸变的一种形式之一，可能是染色体发生断裂或部分落后染色体在细胞分裂的后期行动滞后，不能进入子细胞的主核而成[16-17]。微核多出现于细胞分裂的间期，但在细胞分裂的前期、中期、后期均能看到，而末期微核数微乎其微。

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