响应面优化超声波辅助乙醇提取橄榄叶总黄酮的工艺研究

项昭保,伍晓玲,钟 雪

(1.重庆工商大学环境与资源学院,重庆 400067;2.天然药物研究重庆高校市级重点实验室,重庆 400067;3.重庆工商大学评估与督导办公室,重庆 400067)

中华人民共和国卫生部首批公布的药食两用物种橄榄,是橄榄属植物橄榄(CanariumalbumL.)的果实,具有较高的营养价值[1]和较多的药用价值,如解酒护肝[2]、抗氧化[3]、抗菌[4]、消炎[5]、抗乙肝病毒[6]、抗HIV[7]、防癌[8]等。《本草纲目》的记载,橄榄属植物橄榄的叶子亦可入药,现代药理研究表明,橄榄叶提取物有较好的抑菌作用[9],其内含有没食子酸、穗花杉双黄酮和槲皮素等单体化合物[10]。总体来说,有关橄榄叶的研究并不多,但有较多油橄榄叶提取物的报道[11-13],而且报道题目也多写成橄榄叶提取物[12-13],易引起混淆,油橄榄俗称洋橄榄(OleaeuropaeaL.)为木犀榄属植物,并非本文研究对象,即中华人民共和国卫生部首批公布的药食两用橄榄(C.album),应注意区分。

黄酮类化合物广泛存在于自然界中,具有保护心血管、保肝、抗氧化、抗菌等多种生理活性,来源于药食两用植物中的黄酮用于开发保健食品[14]是当前研究热点。橄榄叶中含有黄酮类化合物,且橄榄叶总黄酮(以下简称TFLC)具有较好的抗氧化活性[13],但制备方法不多且得率较低,如刘玉红等[15-16]采用超声和微波两种辅助技术分别提取TFLC,其得率均不足2%;林烽[17]采用传统热回流乙醇浸提法提取TFLC并优化工艺,该最佳工艺得率达4.75%。超声波与微波同作为现代辅助提取技术,相比于传统提取技术,具有提取时间短、得率高等优点,已在天然产物提取中广泛应用[18-20],在TFLC提取研究的报道中,超声或微波提取得率却低于传统热回流乙醇浸提。为进一步研究TFLC超声提取,得到一条制备效率较高的TFLC提取工艺,本文采用响应面分析法优化超声波辅助提取橄榄叶总黄酮的提取工艺,明确超声波辅助提取技术对TFLC的提取效果,为进一步开发和充分利用橄榄叶中黄酮类活性物质提供相应的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

橄榄叶 2014年7月新鲜橄榄叶采摘,除杂,晒干,粉碎后过60目筛储存在广口瓶中备用,重庆市江津区石蟆镇橄榄种植基地;芦丁对照品 成都普思生物科技有限公司;其余试剂 均为国产分析纯。

KS-150D型超声提取仪 浙江省宁波市科生仪器厂;T6型新悦分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;SQP124型天子分析天平 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 TFLC提取方法 准确称取2.0000 g的橄榄叶样品,按一定的液料比加入一定浓度的乙醇溶液,设定相应的超声提取时间、提取温度和超声波功率,进行超声辅助乙醇提取TFLC[21]。

1.2.2 标准曲线的建立 精确称取芦丁对照品20.0 mg配制成浓度为0.80 mg·mL-1的芦丁标准溶液。参照文献[21]用分光光度法测定梯度浓度溶液的吸光度并制作标准曲线。

1.2.3 单因素实验 选取工艺中的超声时间、超声功率、提取温度、乙醇浓度和料液比为影响因素,平行实验三次,考察各因素对TFLC得率的影响。

1.2.3.1 超声波作用时间对TFLC得率的影响 分别准确称取2.0000 g的橄榄叶样品5份,分别按液料比15∶1 mL/g加入75%乙醇溶液,在超声波功率为200 W,提取温度40 ℃的实验条件下依次提取10、20、30、40、50 min,提取液过滤、定容、测定并计算TFLC得率,平行实验三次。

1.2.3.2 超声波功率对TFLC得率的影响 分别准确称取2.0000 g的橄榄叶样品6份,分别加入按液料比15∶1 (mL/g)加入75%乙醇溶液,在提取温度40 ℃,超声波功率为50、100、150、200、250、300 W的实验条件下分别提取40 min。提取液过滤、定容、测定并计算TFLC得率,平行实验三次。

1.2.3.3 提取温度对TFLC得率的影响 分别准确称取2.0000 g橄榄叶样品5份,分别按液料比15∶1 (mL/g)加入75%乙醇溶液,分别在30、40、50、60、70 ℃温度下,250 W超声功率的实验条件下提取40 min。提取液过滤、定容、测定并计算TFLC得率,平行实验三次。

1.2.3.4 乙醇浓度对TFLC得率的影响 分别准确称取2.0000 g橄榄叶样品5份,分别按液料比15∶1 (mL/g)加入浓度分别为 55%、65%、75%、85%、95%乙醇溶液,在超声波功率250 W、提取温度50 ℃的实验条件下,分别提取40 min。提取液过滤、定容、测定并计算TFLC得率,平行实验三次。

1.2.3.5 液料比对TFLC得率的影响 分别准确称取2.0000 g橄榄叶样品5份,分别按液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 (mL/g)加入85%乙醇溶液,在超声波功率为250 W、提取温度为50 ℃的实验条件下分别提取40 min。提取液过滤、定容、测定并计算TFLC得率,平行实验三次。

1.2.4 响应面法优化TFLC的超声辅助提取工艺 基于Box-Benhnken设计原理,选取影响TFLC得率的主要因素,即提取温度、乙醇浓度、超声功率,然后进行三因素三水平中心组合实验,应用响应面分析法优化总黄酮的提取工艺参数,每组实验重复三次。

表1 Box-Behnken的中心组合因素水平表

1.2.5 TFLC得率的计算 准确吸取1 mL TFLC提取液,用浓度为30%的乙醇水溶液定容到25 mL的容量瓶中。根据1.2.2方法测定吸光度值。平行实验三次,橄榄叶样品中的总黄酮得率按芦丁标准品计,即:

式中,D:TFLC得率,%;C:待测液中总黄酮的浓度,mg·mL-1;T:溶液配制的稀释倍数;V:提取液总体积,mL;M:橄榄叶粉末质量,g。

1.3 数据处理

实验操作重复三次取平均值,计算标准误差并制图分析。响应面实验所得数据运用Design expert 8.0.6软件进行处理、分析,选择最佳提取工艺参数。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

根据实验方法中1.2.2得到标准曲线,如图1所示,回归方程为:A=5.7813C+0.003,相关系数R2达0.9993,这表明在所测浓度范围(0.032～0.16 mg·mL-1)内,吸光度值A与芦丁溶液的浓度C之间线性相关性很好。

图1 芦丁的标准曲线

2.2 单因素实验结果

2.2.1 超声波时间对TFLC得率的影响 根据图2可知,在40 min的时间范围内,TFLC得率随着超声波提取时间的增加而增大;超声提取时间大于40 min以后,TFLC得率略有下降,这可能是随着超时时间增加,在乙醇溶剂中有些黄酮发生一些反应,导致化学结构被破坏。这也与刘玉红[16]采用超声波辅助提取TFLC的最佳提取时间40 min一致,因此在随后的单因素实验中选择的超声波提取时间为40 min,且不作为响应面考察条件。

图2 超声提取时间对TFLC得率的影响

2.2.2 超声波功率对TFLC得率的影响 根据图3可知,在超声功率250 W之前,超声功率增加,TFLC得率也随之增大,但当超声波功率超过250 W之后,TFLC的得率却开始出现一定程度的下降。这可能是提取时间一定的前提下,大功率的超声波导致有些黄酮在乙醇溶剂中发生一些反应从而某些黄酮物质结构被破坏,最终导致总黄酮得率有所下降,这与王涓等[22]报道相符,故根据实验结果,选取超声波功率200、250、300 W作为下一步的响应面考察条件。

图3 超声功率对TFLC得率的影响

2.2.3 提取温度对TFLC得率的影响 根据图4可知,在温度低于50 ℃之前,随着提取温度的增加,TFLC得率也逐渐增大,但当提取温度高于50 ℃后,TFLC得率却开始逐渐减少,可这能与较高的温度会导致某些黄酮物质结构被破坏,从而最终导致TFLC的得率反而有所下降,这与曲中堂等[21]报道一致,根据实验结果,因此选择45、50、55 ℃ 这3个温度作为下一步的响应面实验考察条件。

图4 提取温度对TFLC得率的影响

2.2.4 乙醇浓度对TFLC得率的影响 根据图5可知,在乙醇浓度低于85%时,随着乙醇浓度的增加,TFLC得率也随之增加,但当浓度超过85%后,TFLC得率不再增加,反而开始有所下降,这与刘玉红[16]乙醇浸提TFLC确定的乙醇浓度为80%相近,这是极性相似相溶原理的结果,与TFLC的极性大小相关,故根据实验结果,选择80%,85%和90%作为响应面考察条件。

图5 乙醇浓度对TFLC得率的影响

2.2.5 液料比对TFLC得率的影响 由图6可知,当液料比在10∶1～25∶1 (mL/g)之间,TFLC的得率与液料比增加成正比,然而当液料比超过25∶1 (mL/g)后,TFLC的得率却基本没有变化,这可能是在液料比较低时,随着液料比增大,溶剂量增多,橄榄叶样品在溶液中的分散程度也增大,接触面积增大,有利于TFLC的提取。但随着液料比增大到一定程度后,TFLC得率增长量开始明显放缓,而且液料比太大,会造成溶剂的浪费,因此本研究中,当料液比达到25∶1 (mL/g)时,溶剂对TFLC溶解已达到平衡,增加溶剂量对增加总黄酮的得率几乎无影响,这与邓梦琴等[23]报道一致。故本次实验中设定料液比为25∶1 (mL/g),并且不作为响应面考察条件。

图6 液料比对TFLC得率的影响

2.3 响应面法优化TFLC的提取工艺

依据前面的单因素实验结果,进一步应用三因素三水平的Box-Behnken中心组合实验设计。并选择超声功率、乙醇浓度和提取温度作为自变量,TFLC得率作为响应值。实验设计及结果如表2所示。

表2 响应面分析方案及实验结果

采用design expert 8.0.6软件对所得实验结果作二次回归拟合,把获得的TFLC得率对自变量超声功率、乙醇浓度和提取温度开展二次多项回归,得到二阶多项式的数学模型如下:

Y=5.41+0.34A+0.25B-0.45C-0.02AB+0.02AC+0.1BC-1.25A2-0.57B2+0.26C2

该数学模型是否可靠,可通过相关系数与方差分析结果来考察。由表3可知,模型的相关系数R2=97.37%,大于0.8,表明拟合度很好[24],即响应值TFLC得率实际值与预测值之间具有很好的拟合度;模型的P(Pr>F)值<0.0001,远小于0.01,这说明所得的回归方程非常显著;最后,失拟项的Pr大于0.05,说明在置信度为95%时,实验结果和预测模型匹配得很好。因此该数学模型成立。而且,一次项A和C对Y值的影响高度显著(p<0.01),B对Y值也有显著的影响(p<0.05),二次项A2对响应值Y具有极其显著的影响(p<0.0001),B2对响应值Y也具有高度显著的影响(p=0.0009),C2对Y值也有显著的影响(p<0.05)。

表3 回归分析结果

当响应曲面坡度陡峭,则说明响应值受变量交互作用明显,反之,当响应曲面坡度平滑,则说明响应值受各个变量变化的影响小。通过比较图7～图9,考察超声功率、乙醇浓度和提取温度这三个因素两两之间的交互作用对TFLC得率的影响不显著。

图7 超声功率和提取温度对TFLC得率的交互影响

图8 超声功率和乙醇浓度对TFLC得率的交互影响

图9 乙醇浓度和提取温度对TFLC得率的交互影响

2.4 最佳提取工艺的预测和验证

通过响应面分析结果,最佳提取工艺参数如下,即:超声功率为287.34 W,乙醇溶液浓度为80%,提取温度为50.57 ℃,预测得率为5.68%。为实际操作的方便,将实际工艺参数调整为超声功率285 W,乙醇溶液浓度80%,提取温度51 ℃,并进行了5次平行实验,在此提取参数下,TFLC的实际得率可达5.83%,实际得率与理论预测值的相对误差仅有2.64%。

3 结论

依据单因素实验结果,并通过三因素三水平的Box-Behnken中心组合实验设计,得到了超声波辅助提取TFLC的最佳工艺,即:超声功率为285 W,乙醇溶液浓度为80%,超声提取时间为40 min,提取温度为51 ℃和液料比为25∶1 (mL/g)。在该工艺条件下TFLC的得率可达5.83%,表明超声波辅助提取技术有助于提高TFLC制备效率。此外,TFLC含量较高、制备较易,原料食用安全,值得进一步开发和利用。

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