苜蓿根瘤菌在不同基质中与紫花苜蓿共生匹配的研究

2018-05-29杨淑君何永攀梁维维侯钰荣

草食家畜 2018年3期

杨淑君，何永攀，柯梅，李莉，梁维维，侯钰荣

（新疆畜牧科学院草业研究所，新疆乌鲁木齐 830000）

生物固氮主要是指利用能够消化分解氮元素的有益微生物，通过微生物体内酶的一系列复杂的生化反应之后，将空气中的氮气转化为氨根离子，从而被植物根系更好的吸收和利用。生物固氮是整个生态系统中氮元素利用的重要组成部分。生物固氮对反应条件要求不高，通常在室温环境下就能进行，它能够将空气中的氮元素首先还原成氨气，然后氨气和水分接触后形成氨水，进入土壤后，以铵根离子被作物吸收。而传统化肥制备过程中利用氮气合成肥料，往往需要高温高压条件下才能进行，资源消耗量较高，并且在生产过程中很容易对环境造成污染。在自然系统中固氮形式主要有两种，第一种是微生物自行固氮，是指微生物不需要借助在其它动物和植物体内而进行的一种独立固氮模式。另一种是指固氮微生物在生长过程中必须和其他植物有效结合在一起，以植物为寄生场所，通过根系作用，为有益微生物获得更多氧气，在充足氧气供给下，固氮微生物可以将空气中的氮气转化为氨气，供植物利用。共生固氮模式中氮元素扮演着十分重要的角色。而紫花苜蓿是多年生的草本植物，抗寒抗旱能力强，耐贫瘠，种植范围广泛，是世界种植范围最广的豆科类牧草。该种牧草产量高，适口性好，品质优，经济价值和营养价值都很高。紫花苜蓿不仅具有很强的固氮能力，而且具有发达的根系，对保持水土，避免水土污染具有积极作用。

1 材料和方法

1.1 一般材料选取

1.1.1 培养基选择

本次研究过程中，主要选择了YMA培养基TY液体培养基，Gibson微量元素液，Fahraeus无氮植物营养液。供试菌株主要选择由黑龙江生物有机肥工程技术研究中心提供的HLJ30、HLJ32、HLJ35、HLJ37、HLJ38、HLJ39、HLJ40、HLJ41根瘤菌菌株，寄主主要是紫花苜蓿。本次研究中选择了两种基质，分别为风化煤和蛭石。

1.1.2 苜蓿品种选择

紫花苜蓿品种由新疆自治区草原管理站提供，选择从国外引进的抗逆性较强的紫花苜蓿品种巨人201，该品种来自于美国，休眠级数2.0，发芽率在94%以上，抗寒性能极强，是寒冷地区表现较佳的一种紫花苜蓿引进品种。

1.1.3 药品与仪器

试剂有盐酸、氢氧化钠、硫酸、磷酸钠磷酸二氢钾、氯化钠、二水硫酸钠、磷酸钾、95%、乙醇、甲烯蓝、甲基红、硼酸、琼脂粉，胰蛋白胨、酵母粉、硫酸铜、七水高锰酸钠、七水硫酸镁、柠檬酸铁等均为国产分析纯；其次，试验仪器选择。本次研究过程中，试验仪器主要涉及气相色谱、恒温震荡培养箱、高压灭菌锅、电热鼓风干燥箱、电热恒温培养箱、垂直流超净工作台、显微镜、紫外线分光光度计、PH计、20孔消煮炉、生化培养箱等。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计

首先，在风化煤和蛭石两种不同的种植基质中，将本次研究所选择的紫花苜蓿品种用八种不同的根瘤菌菌株进行有效处理，同时设置不经过菌种处理的对照组，每个处理重复三次；其次，基质处理。将蛭石和风化煤两种基质分别用营养液进行处理，然后将处理得到的基质放入到容器中进行高温灭菌处理。在121℃条件下，湿热灭菌处理1 h后备用；再次，紫花苜蓿种子催芽。选择颗粒饱满，无明显机械损伤、病虫害危害的紫花苜蓿种子。先将紫花苜蓿种子使用浓度为75%的酒精溶液消毒6 min，然后使用蒸馏水清洗紫花苜蓿种子5～6次，使用次氯酸钠再次对种子进行全面消毒，然后再使用蒸馏水清洗5～6次。

将经过处理后的种子均匀的放在1%的琼脂平板上，28℃度恒温箱黑暗培养36 h，等到紫花苜蓿根长到1～2 cm时即可以接种根瘤菌；最后根瘤菌接种。在培养皿中加入制备好的菌悬浊液，再加入适量的催好芽的苜蓿种子，作用15 min后用无菌镊子取苜蓿种子装入无菌基质的塑料杯中，每个处理种植3株，然后再向植株根部加入制备好的菌液5 mL，昼夜温度维持在23℃，日照小时数控制在16 h。培养60 d后开始收获紫花苜蓿，测定紫花苜蓿株高、干物质以及全氮含量。

1.2.2 植物样品分析

首先，植物干重测定。以第一片叶子叶痕处作为划分标准，将培养好的紫花苜蓿地上部分刈割后在80℃温度下烘干称量干重；其次，紫花苜蓿全氮含量测定。全氮含量测定，采用凯氏定氮法测定总氮含量。总氮含量等=[（滴定样样品时消耗盐酸的含量-滴定空白对照用去盐酸的含量）×标准盐酸摩尔数×14×6.25]/（测定样品干重×1 000）×100；最后，株高测定。从子叶痕迹处到距离生长点最近的展开叶顶端。

1.3 数据处理

本次研究过程中，采用DPS统计学软件和excel软件进行数据分析和处理。

2 结果与分析

2.1 蛭石栽培试验

2.1.1 紫花苜蓿根瘤菌结瘤情况

通过对表1数据进行分析接种根瘤菌后，能够显著提高雌花苜蓿根部的结瘤能力，巨人201品种接种根瘤菌后，根瘤数量和对照组相比差异性显著，其中增长最多的是HLJ32，增长了3570.72%，增长最少的是HLJ41相比对照组仅增长了636.62%。通过以上数据分析可以看出，同一个苜蓿品种接种不同根瘤菌，其结瘤效果也存在一定差异性。

表1 紫花苜蓿品种接种不同根瘤的根部结瘤情况

2.1.2 紫花苜蓿品种接种不同根瘤菌株高对比

通过对表2数据分析发现，同一个紫花苜蓿品种接种不同根瘤菌对株高影响较大，紫花苜蓿接种同一个根瘤菌，差异性也比较显著。巨人201接种不同根瘤菌后，增长最显著的是HLJ32，增长率为88.50%。

表2 紫花苜蓿品种接种不同根瘤菌株高对比

2.1.3 地上部分生物量比较

通过对表3数据分析发现，同一个紫花苜蓿品种接种不同根瘤菌后，均能够有效提高植株地上部分的干重，与紫花苜蓿巨人201匹配较好的菌种有HLJ35、HLJ37和HLJ38，这两个菌种均能够有效促进紫花苜蓿地上部分生物量增长，分别增长了450.00%、455.56%和472.22%，详细情况如表3所示。

表3 紫花苜蓿生物量比较

2.1.4 全氮含量比较

通过对表4数据分析发现，紫花苜蓿，通过菌种处理之后，全氮含量普遍高于对照组。接种了八种根瘤菌后，全氮含量差异性很大。HLJ35、HLJ37、HLJ38和对照组相比，差异性显著，分别增长了65.64%、78.84%、71.07%。

表4 全氮含量比较

2.2 风化煤栽培试验

2.2.1 紫花苜蓿根瘤菌结瘤情况

通过对表5数据进行分析，发现接种根瘤菌后，能够显著提高雌花苜蓿根部的结瘤能力，巨人201品种接种根瘤菌后，根瘤数量和对照组相比差异性显著，其中增长最多的是HLJ38，增长了2 350.00%，增长最少的是HLJ39相比对照组仅增长了1 038.36%。通过以上数据分析可以看出，同一个苜蓿品种接种不同根瘤菌，其结瘤效果也存在一定差异性。

表5 紫花苜蓿品种接种不同根瘤的根部结瘤情况

2.2.2 紫花苜蓿品种接种不同根瘤菌株高对比

通过对表6数据分析发现，同一个紫花苜蓿品种接种不同根瘤菌对株高影响较大。巨人201接种根瘤菌后，增长最显著的是HLJ35，增长率为80.73%。

表6 紫花苜蓿品种接种不同根瘤菌株高对比

2.2.3 地上部分生物量比较

通过对表7数据分析发现，同一个紫花苜蓿品种接种不同根瘤菌后，均能够有效提高植株地上部分的干重，与紫花苜蓿巨人201匹配较好的菌种有HLJ37，这个菌种均能够有效促进紫花苜蓿紫花苜蓿生物量增长，地上部分生物量增长了704.76%。

表7 地上部分生物量比较

2.2.4 全氮含量比较

通过对表8数据分析发现，紫花苜蓿通过菌种处理之后，全氮含量普遍高于对照组。接种了八种根瘤菌后，全氮含量差异性很大。HLJ32、HLJ35、HLJ38和对照组相比差异性显著，分别增长了122.05%、135.43%、111.02%。

表8 全氮含量比较

3 讨论

研究采用了风化煤和蛭石两种基质，进行紫花苜蓿根瘤菌共生匹配试验。从本次研究的结果来看，从接种八种不同的根瘤菌所表现出来的接种效果，存在较大差异性。同一种紫花苜蓿接种不同种类根瘤菌并不能获得同样的效果，只有某种根瘤菌品种，能够与紫花苜蓿表现出很好的共生关系，这种关系就说明了在根瘤菌选择过程中，一定要结合紫花苜蓿的需求综合确定。只有做到这样才能确保根瘤菌进行有效固氮。试验中筛选出的各种匹配的共生根瘤菌来看，接种根瘤菌和不接种根瘤菌之间有着显著差异，紫花苜蓿接种根瘤菌，能够显著提高紫花苜蓿的地上部分生物量，这说明了根瘤菌在紫花苜蓿地上部分生长中，扮演着十分重要的角色。尤其是在干旱、荒漠、贫瘠地区种植紫花苜蓿并接种相匹配的根瘤菌，对改良土壤，提高产量，保护生态环境都具有重大现实意义。

以蛭石和风化煤作为基质进行根瘤菌与苜蓿品种共生匹配试验结果来看，接种根瘤菌都能够显著促进紫花苜蓿根瘤数量、平均株高、生物量和全氮含量的增长。从增长数量来看，以风化煤作为基质，进行根瘤菌和苜蓿品种之间匹配的固氮效果和生物量均高于另外一种基质，由此可以将风化煤作为选择苜蓿根瘤菌菌种的优先培养基质。这与慈恩研究的不同环境因子对紫花苜蓿—根瘤菌共生体系的影响内容基本一致。

本次试验过程，主要测定了植株的全氮含量、平均株高、地上部分干重、根瘤数量，这其中植株地上部分干种被普遍用作衡量苜蓿和根瘤菌之间共生效果的主要指标。因此，在以上基质中进行共生匹配研究，可以用干重、全氮含量对根瘤菌的共生效果进行评价，而平均株高，根瘤数量可以作为评价的参考依据。

对紫花苜蓿接种适合其生长的高效根瘤菌，通过共生固氮作用，不仅能够进一步提高苜蓿产量，而且还具有很高的生态效益。所以，对紫花苜蓿接种适合的根瘤菌，对促进大面积种植紫花苜蓿，进一步推动我国农业和环境可持续发展具有重大现实意义。

参考文献：

[1]李富宽,翟桂玉,沈益新,等.施磷和接种根瘤菌对黄河三角洲紫花苜蓿生长及品质的影响[J].草业学报，2005,（03）:87-93.

[2]曾昭海,隋新华,胡跃高,等.紫花苜蓿-根瘤菌高效共生体筛选及田间作用效果[J].草业学报，2004,（05）:95-100.

[3]曾昭海,陈丹明,胡跃高,等.不同生态区若干典型作物土壤中紫花苜蓿土著根瘤菌分布状况[J].草业科学，2003,（10）:26-28.

[4]朱兆良.合理使用化肥充分利用有机肥发展环境友好的施肥体系[J].中国科学院院刊，2003,（02）:89-93.

[5]郭海玉,罗明,何媛,等.新疆紫花苜蓿根瘤菌XGL026发酵条件的响应面法优化筛选[J].草地学报,2016,24（03）:624-631.

[6]周冀琼,邓波,马晓彤,等.紫花苜蓿根瘤菌培养基的优化研究[J].草地学报,2013,21（03）:607-611.

[7]罗明.新疆紫花苜蓿根瘤菌遗传多样性与系统发育研究[A].中国微生物学会微生物资源专业委员会.第四届全国微生物资源学术暨国家微生物资源平台运行服务研讨会论文集[C].中国微生物学会微生物资源专业委员会，2012.

[8]慈恩.不同环境因子对紫花苜蓿—根瘤菌共生体系的影响[D].重庆：西南农业大学,2005.

[9]师尚礼.紫花苜蓿根瘤菌研究进展[J].甘肃农业大学学报,2005，（02）:262-267.