重庆市男男性接触者HIV-1感染者原发耐药性分析*

何惊春，凌 华，张 敏，王 越，吴国辉，卢戎戎，周全华△（.九龙坡区疾病预防控制中心，重庆400039；.重庆市疾病预防控制中心，重庆40004）

男男性接触（MSM）者由于其多性伴、性伴更换频率高、不安全性行为等因素，成为人类免疫缺陷病毒（HIV）感染的危险人群。1981年美国洛杉矶和纽约首次报道的获得性免疫缺乏综合征（AIDS）患者便是

MSM[1]。西欧和北美的研究显示，MSM人群是HIV耐药发生的主要高危人群之一[2]。由于我国MSM人群具有安全套使用率低、多性伴和双性恋比例高等特点[3-4]，使我国MSM人群成为HIV向普通人群传播的桥梁。MSM

人群中耐药株的流行情况可以从一定程度上反映新发

HIV感染者中耐药株的传播情况。本研究对重庆市门诊调查新发现的148例感染者治疗前的血样进行基因型耐药研究，分析该人群耐药的流行情况。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年1月至2015年12月重庆市疾病预防控制中心性病门诊调查新发现、经流行病调查其传播途径为MSM、经AIDS确证实验室蛋白质印迹法（Western blotting）试验确证为HIV-1阳性的148例感染者。年龄 16～62岁，平均（28.65±8.34）岁。采集患者的外周血置于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中，立即混匀，于6 h内常规离心机抗凝血分离血浆，分装后-80℃冻存，用于耐药基因型检测。

1.2 方法

1.2.1 病毒基因组RNA提取 参照QIAGEN公司Viral RNA Extraction Kit操作。

1.2.2 In-house方法扩增蛋白酶编码区及逆转录酶编码区 参照全国HIV耐药监测网络和检测技术制订的标准操作程序操作，用In-honse方法扩增HIV-1蛋白酶基因区（pol区）全序列与部分逆转录酶序列，引物均由TAKARA生物工程有限公司合成，引物见表1。第1轮聚合酶链反应（PCR）引物为MAW-26、RT-21，体系试剂使用TAKARA公司生产的PrimeScriptTMOne Step RTPCR Kit Ver.2（Dye Plus）。反应条件为：50 ℃ 30 min；94℃ 2 min；94℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 1.2 min 30个循环；72℃10 min；4℃保温。第2轮PCR引物为PRO-1、RT-20，体系试剂使用Promega生物有限公司生产的GoTaq Hot Start Polymerase。反应条件为：94 ℃ 5 min；94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 2.5 min；4℃保温。

表1 引物名称、序列、位置

1.2.3 目的片段的回收、纯化及基因测序 采用RTPCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳观察确定相对分子质量后，将产物送诺赛基因有限公司纯化并测序。

1.2.4 耐药基因分析 所得的序列用Chromas2.6软件进行编辑校正后，序列上传至https：//hivdb.stanford.edu/网址，利用HIV db系统进行耐药性分析，获得样本对各类药物耐药的最终解释。

2 结 果

2.1 亚型情况 对蛋白酶和逆转录酶区序列进行系统发生分析结果显示，76.35%（113/148）为CRF07-BC亚型重组，19.59%（29/148）为CRF01-AE亚型重组，2.03%（3/148）为 B 亚型，2.03%（3/148）为 CRF55-01B 亚型重组。

2.2 蛋白酶抑制剂相关耐药变异情况 148例标本中检出3例原发性突变，其中1例CRF01-AE重组亚型毒株携带M46L原发性变异，该变异造成对阿扎那韦（ATV/r）、呋山那韦（FPV/r）、茚地那韦（IDV/r）、克力芝（LPV/r）、沙奎那韦（SQV/r）、替拉那韦（TPV/r）潜在耐药，1例CRF07-BC重组亚型毒株发生K20T原发性突变，1例CRF07-BC重组亚型毒株发生Q58E原发性突变，这2例突变未造成对蛋白酶类药物的耐药。

2.3 逆转录酶抑制剂相关耐药变异 148例标本中14例标本出现非核苷类逆转录酶抑制剂（NNRTIs）相关耐药突变，发生在 V179（12/14）、E138（1/14）和 G190（1/14），其中1例CRF01-AE重组亚型发生V179VD原发性变异，该变异造成对依非韦伦（EFV）、奈韦拉平（NVP）的中度耐药，1例B亚型发生G190A原发性变异，该变异造成对NVP高度耐药，对EFV中度耐药。其他12例标本的原发性耐药均造成EFV、ETR、NVP、RPV的潜在耐药。

3 讨 论

本研究发现，存在 CRF07-BC、CRF01-AE、B、CRF55-01B等4种亚型，所占比例分别为76.35%、19.59%、2.03%和2.03%。这与深圳市[5]、北京市调查的CRF01-AE为主的亚型分布不一致[6]，但和贵州省[7]、四川省调查的亚型分布趋势极为相似[8]。分析这一结果，可能与MSM人群流动性、人群本身特性、HIV传入MSM人群的方式有关。

HIV/AIDS患者出现耐药性主要来自2种途径，一种是感染了耐药毒株（即原发性耐药），另一种是敏感株在药物的压力下向突变产生的耐药株（即继发性耐药）转变[9]。高效抗病毒治疗（HAART）能够抑制HIV-1病毒的复制，延长患者生命，提高其生命质量，降低病死率，但如果患者依从性不好，导致病毒未能完全抑制，则有可能产生继发性耐药毒株，而耐药株的大量复制是导致抗病毒治疗失败的主要原因之一。资料显示，原发性耐药毒株出现在新发感染者中证明了耐药株的传播。欧美等发达国家10%以上的新发HIV感染者至少对1种抗病毒治疗药物耐药[10-11]。然而，与其他人群比较，MSM人群中的原发耐药发生率更高[12]。若采用世界卫生组织的耐药监测突变列表，且不考虑次要突变，MSM人群中阿根廷原发耐药发生率为7.7%（2006—2008年）[13]，以色列原发耐药发生率为29%[12]，我国天津市、贵州省和四川省、深圳市等省市原发耐药突变率分别为 20.0%[14]、22.4%[7]、25.9%[8]、22.5%[15]。本研究中，重庆市MSM人群原发耐药突变率为11.5%（17/148），低于上述省市，但仍处于中度流行水平。

MSM新发感染人群中，耐药突变发生率最高的是在RT区。纽约市核苷类逆转录酶抑制剂（NRTIs）耐药相关突变为30%，NNRTIs耐药相关突变为27.7%；天津市RTIs耐药相关突变为18%，NNRTIs耐药相关突变为24%[14]。本研究中突变最高的也在RT区，未出现NRTIs的耐药突变，NNRTIs耐药相关突变为9.46%。据资料显示，当PI突变单独或者联合出现都不能导致治疗的早期失败，但与主要耐药相关突变同时出现则可能会提高毒株的适应性，从而使复制水平提高，最后转为耐药[16]。本研究中，重庆市蛋白酶抑制剂（PIs）耐药相关突变为2.0%。低于天津市的14%和纽约市的18.1%[14，17]。

本研究结果表明，HIV-1耐药毒株已经在重庆市MSM人群中发生了传播。由于MSM人群特殊的性行为方式和其隐蔽性，这些因素不仅加速了HIV耐药株在MSM人群内部的蔓延，也有可能作为桥梁传播给其他人群。因此应加强MSM人群HIV-1耐药毒株传播的监测和检测，尤其是治疗前检测，这将有利于为患者选择合适的治疗方案，充分发挥抗病毒治疗药物的作用，控制和延缓MSM人群中耐药株的流行。此外，应加强对MSM人群行为学等方面的干预和治疗患者的管理，防止HIV耐药毒株的传播。

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