发酵剂对紫苏秸秆发酵饲料品质及营养成分的影响

郭鹏辉，韦 体，刘慧霞，高丹丹，臧荣鑫，卢建雄，蔡 勇，杨具田

(西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃 兰州 730030)

随着天然草地退化、土地资源紧缺以及人畜争粮等问题的日益突出，加之传统畜牧业生产对粮食的过度依赖，使得大力发展节粮型、经济型的现代畜牧业成为我国畜牧业发展的趋势之一。秸秆作为农业生产系统中一项重要的再生性生物资源，是世界上最丰富的动物饲料来源之一[1]。据估计，全世界每年可产生近29亿 t的秸秆，其中66%直接还田或作为生活能源而被焚烧掉，仅有12%作为草食家畜的饲料[2]。而作为一个秸秆资源极其丰富的农业大国，中国每年由各类农作物产生的秸秆总量超过8亿t，并且具有逐年递增的趋势[3]。同时在传统的秸秆资源利用方式过程中，一方面，大约有1/3的秸秆资源被就地焚烧掉，这种利用方式不仅严重污染了当地的生态环境，更是造成了农业资源的极大浪费[4]；另一方面，作物秸秆中粗纤维含量高(30%～45%)，粗蛋白含量低(2%～5%)，导致秸秆的消化率都很低，一般只有35%～50%[5]，这限制了反刍家畜对秸秆的利用，致使采食量下降，无法满足其需求。所以，目前仅有不到10%的秸秆被用作饲料，如果用2亿 t秸秆通过微生物进行加工处理并用作饲料，每年可节约饲料粮0.8亿t左右，相当于饲料用粮的50%左右[6]。因此，如何合理利用产量如此巨大的农作物秸秆，不仅对于保护种植地的农业生态环境，促进当地农民增收有重要的现实意义，而且对于解决我国畜牧业现代化发展过程中饲草的短缺问题具有重要的战略意义[7]。

紫苏(Perillafrutescens)，俗称荏，又名红苏、赤苏、红紫苏或香苏，是唇形科紫苏属的一年生草本植物，在我国已有2 000多年的栽培种植历史，主要用于医疗、食品和保健等领域，目前在我国西北、东北地区基本形成了两个传统的油用紫苏主产区。紫苏全株都具有很高的开发利用价值，是国家卫生部首批颁布既是药品又是食品的60种植物之一[8]。研究发现，紫苏根、茎、叶及籽实中富含各种氨基酸、维生素及微量元素等营养成分，其秸秆中纤维素和半纤维素的含量可达62.7%，另外还含有少量的有机溶剂抽提物(包括树脂、脂肪、蜡等)、色素及灰分等[9]。在鸡、猪、牛、羊等不同动物日粮中添加紫苏提取物后，肉鸡的生产性能提高，免疫力增强[10]，蛋种鸡的生产和繁殖性明显改善[11]，生长育肥猪的生长发育、肉品质及免疫性得到改善[12]，育肥牛的免疫球蛋白A含量、牛肉嫩度、胴体品质等得到提高[13]，湖羊瘤胃发酵功能增强，且日粮中粗蛋白和粗脂肪的表观消化率显著增加[14]。因此，紫苏可以作为动物日粮中一种很好的饲料来源加以开发利用[15]。

然而，目前人们对紫苏这一植物的研究主要聚焦在其活性成分、遗传特性、资源分布、栽培种植等方面[16-17]，而对其副产品秸秆资源的研究利用缺乏关注。因此，本研究通过微生物发酵法获得发酵后的紫苏秸秆饲料，并进行其发酵饲料的品质评价和营养成分分析，旨在为紫苏秸秆资源的饲料化利用研究提供理论依据和技术参考。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

供试材料紫苏秸秆，是将种植在甘肃省庆阳市宁县大田中的紫苏刈割、去掉籽实并经自然风干后的剩余物。强微99生酵剂及粗纤维降解剂均由强微(宜春)生物科技有限公司提供，里氏木霉RUT C-30(CICC13052)购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

1.2 试验方法

1.2.1发酵菌种的制备

里氏木霉PDA培养基：马铃薯200 g、琼脂15 g、葡萄糖20 g，pH 4.8，蒸馏水1 000 mL。

里氏木霉液体培养基：葡萄糖20 g、蛋白1 g、(NH4)2SO43.0 g、CaCl2·2H2O 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.03 g，1 mL·L-1微量元素浓缩液，1 mol·L-1柠檬酸缓冲液，pH 4.8，蒸馏水1 000 mL。

强微99生酵剂及粗纤维降解剂的配置按照公司给定的使用说明进行。

1.2.2发酵试验设计 将采集的紫苏秸秆通过粉碎机粉碎成粉末状，过0.425 mm筛，然后分别称取1 kg粉碎后的紫苏秸秆样品，按照以下5个处理方法进行处理，分别为对照组、试验组Ⅰ(添加20%玉米粉+1 g·kg-1强微99生酵剂+1 g·kg-1粗纤维降解剂+50 mL·kg-1里氏木霉发酵液)、试验组Ⅱ(添加20%玉米粉+1 g·kg-1强微99生酵剂)、试验组Ⅲ(添加20%玉米粉+1 g·kg-1粗纤维降解剂)、试验Ⅳ(添加20%玉米粉+50 mL·kg-1里氏木霉发酵液)，每个处理设3个重复，各个处理混合均匀后装入锡箔袋中(每袋1 kg)用封口机真空密封，然后放置于30 ℃恒温培养箱中进行固体厌氧发酵，发酵时间为7 d，发酵结束后，将发酵好的秸秆饲料置于-20 ℃冰箱中保存备用。

1.3 样品测定

1.3.1营养成分的测定 发酵结束后，通过四分法从每个发酵袋中取出25 g发酵饲料样品，置于65 ℃烘箱中烘干(48 h)后进行干物质(dry matter，DM)含量测定。根据《饲料分析及饲料质量检测技术》[18]的方法测定发酵饲料中的营养成分，采用高温灼烧法测定粗灰分(Ash)的含量，采用凯氏定氮仪(K9840,山东海能)测定粗蛋白质(crude protein,CP)含量，采用脂肪测定仪(SOX406,山东海能)测定粗脂肪(ether extract,EE)含量，采用粗纤维测定仪(F800,山东海能)测定粗纤维(crude fiber,CF)、中性洗涤纤维(neutral detergent fiber,NDF)、酸性洗涤纤维(acid detergent fiber,ADF)以及酸性木质素(acid detergent lignin，ADL)的含量。

1.3.2pH与挥发性脂肪酸含量测定 称取发酵后的紫苏秸秆饲料20 g放入三角瓶中，并加入180 mL蒸馏水搅拌均匀，然后静置浸泡24 h后，先将浸泡液用两层纱布过滤，再将过滤后的滤液用定量滤纸过滤2次，即可得到浸提液并用pH计测定其pH。挥发性脂肪酸的测定参考文献[19]的方法进行，采用日本岛津(GC-14B)高效液相色谱仪分析检测浸上述所获提液中的乙酸(acetic acid，AA)、丙酸(propionic acid，PA)及丁酸(botanic acid，BA)含量。检测柱：毛细管柱(长30 m，内径0.53 mm)；检测器：FID(温度200 ℃)；载气：高纯氮气(压力0.7 MPa，流速30 NL·min-1)；燃气：氢气(流量30 mL·min-1)；气化室温度：250 ℃；分析灵敏度：101，衰减度25。

1.3.3紫苏秸秆发酵饲料的感官评定 根据《农业部青贮饲料质量评定标准》[20]，对发酵后的紫苏秸秆饲料情况进行现场感官评定，分别为色泽15分，气味15分，质地10分。最终总评分(Score,S)结果分为优等(30分

1.3.4紫苏秸秆饲料发酵品质评定 发酵品质的评定根据V-Score评价体系[21]的方法进行评定，具体评分标准如表1所列。

表1 V-Score评分标准Table 1 Calculation method for the V-Score

1.4 数据处理与统计分析

数据处理结果以平均值±标准误的方式表示，具体分析采用Excel与SPSS 20.0软件中的One-way ANOVA对不同处理进行单因素方差分析(P<0.05)和LSD法多重比较。

2 结果与分析

2.1 紫苏秸秆发酵饲料的营养成分

经不同发酵方法处理后的紫苏秸秆饲料干物质含量显著低于对照(P<0.05)，但不同处理之间差异不显著(P>0.05)(表2)。经不同方法处理后的紫苏秸秆粗蛋白(CP)和粗脂肪(EE)含量明显升高(P<0.05)，粗脂肪含量尤以混合处理(试验组Ⅰ)后的效果最为显著；而粗纤维含量(CF)相对于对照组而言显著降低(P<0.05)，但混合处理(试验组Ⅰ)和里氏木霉发酵液处理(试验组Ⅳ)的效果较为明显，且与对照(62.94%)相比，试验组Ⅰ和Ⅳ的CF含量均降为46%左右。粗灰分(Ash)各处理组之间的变化不大(P>0.05)。混合处理(试验组Ⅰ)与粗纤维降解剂(试验组Ⅲ)处理后能显著降低紫苏秸秆饲料中的中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)的含量(P<0.05)，而试验组Ⅳ处理后的变化不大(P>0.05)，但4种处理方法均能显著降低发酵饲料的酸性洗涤木质素(ADL)的含量(P<0.05)。

2.2 紫苏秸秆发酵饲料的现场感官评定

不同处理之间紫苏秸秆发酵饲料的感官评价差异明显(P<0.05)，且采用强微99生酵剂+粗纤维降解剂+里氏木霉发酵液混合发酵或每种单一发酵后的感官评价等级均为良好，但混合发酵的总体评分最高(27.39)，等级为良好，而单纯添加里氏木霉发酵液发酵后的紫苏秸秆饲料总体评分较低，等级为一般。

2.3 紫苏秸秆发酵饲料的发酵品质

各试验组的pH显著低于对照组(P<0.05)(表4)，试验组Ⅱ与试验组Ⅲ之间的差异不显著(P>0.05)；试验组Ⅰ的氨态氮/总氮、乙酸、丙酸和丁酸的含量均显著低于对照组和试验组Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ(P<0.05)，且对照组最高。

表2 不同处理方法下紫苏秸秆发酵饲料的营养成分Table 2 Nutrients content of Perilla frutescens fermentation straw by different method %

试验组Ⅰ,添加20%玉米粉+1 g·kg-1强微99生酵剂+1 g·kg-1粗纤维降解剂+50 mL·kg-1里氏木霉发酵液;试验组Ⅱ,添加20%玉米粉+1 g·kg-1强微99生酵剂;试验组Ⅲ,添加20%玉米粉+1 g·kg-1粗纤维降解剂;试验Ⅳ,(添加20%玉米粉+50 mL·kg-1里氏木霉发酵液;CK，对照；同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)，下同。

Group Ⅰ, adding 20% corn flour+1 g·kg-1Qiangwei 99 starter cultures +1 g·kg-1crude fiber degradation agent + 50 mL·kg-1Trichoderma fermentation solution; Group Ⅱ, adding 20% corn flour +1 g·kg-1Qiangwei 99 starter cultures; Group Ⅲ, adding 20% corn flour+1 g·kg-1crude fiber degradation agent; Group Ⅳ, adding 20% corn flour + 50 mL·kg-1Trichoderma fermentation solution; CK, control; Different lowercase letters within the same column means significant difference at the 0.05 level, and the same letters indicate no significant difference at the 0.05 level; similarly for the following tables.

表3 紫苏秸秆发酵饲料感官评定Table 3 Sensory score of Perilla frutescens fermentation straw

表4 苏秸秆发酵饲料的发酵品质Table 4 Fermentation quality of Perilla frutescens straw

表5 紫苏秸秆发酵饲料V-score 评分结果Table 5 The V-score of Perilla frutescens fermentation straw

2.4 紫苏秸秆发酵饲料品质评分结果

按照V-score评分标准，不同处理方式下对照组、试验组Ⅲ、Ⅳ的发酵品质评分较低，评价等级为差(Y<60)，且试验组Ⅳ的V-Score评分仅为39.77分；试验组Ⅰ、Ⅱ的评价等级均为良，但试验组Ⅰ的评分最高，说明其发酵效果最好(表5)。

3 讨论

3.1 不同处理对紫苏秸秆发酵饲料营养成分的影响

农作物秸秆细胞壁中因含有一些特殊的木质素、纤维素及半纤维素复合体等物质，限制了草食动物对其的消化吸收及利用，进而阻碍了秸秆细胞内营养物质的释放，导致在直接饲喂过程中家畜的消化利用率低，适口性差且商品化程度低。因此，探索一种经济、安全、高效的农作物秸秆饲料化处理方法，将对我国农业和畜牧业的持续、稳定、快速发展具有非常重要的现实意义[22]。紫苏作为我国卫生部首批公布的药食同源植物，也是我国传统的多用途经济植物，具有十分重要的应用价值[23]，但紫苏的副产品——秸秆因没有引起人们的兴趣和重视，在生产中要么被就地焚烧掉，要么被因遗弃腐烂而白白浪费掉，这不仅造成了生态环境的污染，也导致有效的农业资源未能得到合理的开发利用[24]。而紫苏秸秆之所以未被很好地用于动物日粮的饲料来源和有效补充，主要原因在于其秸秆的质地粗硬，粗纤维含量过高而导致其适口性较差。因此，如何通过技术手段和现有的研究方法，降低紫苏秸秆的粗纤维含量，提高其在饲用时的营养成分，改善适口性，从而提高紫苏秸秆在动物饲料利用中的表观消化率和营养成分利用率，是解决紫苏秸秆饲料化利用过程中的关键所在。

目前，利用生物技术发酵制备秸秆饲料的方法主要有秸秆微贮、利用复合酶制剂和菌酶制剂直接发酵秸秆以及利用秸秆生产单细胞蛋白质等[25]。而酶法和微生物法[26-27]作为目前国内外研究表明行之有效的秸秆饲料化处理方法，用此法处理后得到的秸秆饲料，不仅粗纤维含量下降，适口性得到有效改善，而且粗蛋白、粗脂肪等营养物质进一步提高。用木霉与酵母混合发酵处理后的玉米(Zeamays)秸秆饲料，可使其粗蛋白含量从4.2%提高到19.7%，粗纤维含量从36.2%下降到24.1%[28]；利用复合益生菌发酵处理后的鲜食大豆(Glycinemax)秸秆饲料，其中的Ash、Ca、P、乳酸菌及乳酸等含量显著提高，而CF、NDF、ADF等限制因子也明显降低，从而使发酵饲料品质得到明显改善[29]；强微无抗饲料发酵剂发酵药渣饲料后能明显改善饲料的适口性，提高羊的采食量[30]。本研究表明，采用强微99生酵剂+粗纤维降解剂+木霉发酵液混合发酵紫苏秸秆能显著提高秸秆饲料的CP、EE的含量，明显降低CF、ADF、NDF及ADL的含量，从而提升发酵饲料的感官与品质评分，进而改善发酵品质。同时，上述处理方法主要是通过添加菌制剂和酶制剂，降低秸秆中纤维素、半纤维素和木质素的含量，改善秸秆微贮饲料的品质和营养成分，提高其有氧稳定性。有研究表明，酶菌混合处理后的玉米秸秆pH 和可溶性糖(water soluble sugar,WSC)显著降低，CP含量提高，NDF、ADF、ADL含量显著低于单一处理及对照组[31]，而利用商业秸秆发酵剂、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和酵母菌发酵玉米秸秆，发酵后CP含量增加1.068倍，CF、NDF及ADF含量分别降低20.15%、58.83%和42.32%[32]。本研究中，经过不同粗纤维降解发酵剂处理后的紫苏秸秆，与对照组相比，4个试验组的CF和ADL的含量显著降低(P<0.05)，CP和EE的含量显著升高(P<0.05)，与大多数的研究结果一致[33-34]，即利用不同粗纤维降解剂处理紫苏秸秆后制备成的紫苏秸秆发酵饲料营养价值明显得到改善，表明采用粗纤维降解剂降解紫苏秸秆中的粗纤维后，再通过发酵处理制备成饲料具有理论上的可行性。

3.2 不同处理方式对紫苏秸秆发酵饲料品质的影响

V-score发酵饲料评分体系是以氨态氮与乙酸、丙酸及丁酸等挥发性脂肪酸的含量为指标进行各项分数计算和发酵饲料的品质评价的，利用该评定体系可以相对客观地反映发酵饲料的品质[19]。本研究表明：经过不同降解剂降解发酵处理后的紫苏秸秆发酵饲料，试验组Ⅲ、Ⅳ的发酵品质评分较低，评价等级为差(Y<60)，且试验组Ⅳ的V-Score评分仅为39.37分；试验组Ⅰ、Ⅱ的评价等级均为良，其中试验组Ⅰ的评分最高(V-Score=75.51)，说明其发酵效果最好。而作为秸秆发酵的关键指标，有机酸含量高低不仅决定了饲料的适口性，而且对发酵品质的影响至关重要[35]，其中最重要的是乳酸、乙酸和丁酸的含量，经腐败菌等有害微生物分解蛋白质、葡萄糖和乳酸后所产生的重要产物——丁酸，其含量越低，则饲料中有害微生物的活性也越低，发酵品质就越好[20]。同时，在秸秆饲料发酵过程中，作为评价发酵饲料品质好坏的重要观测指标[36-37]，氨态氮与总氮的比值越高，蛋白质与氨基酸的分解就越多，发酵饲料的品质就越差。而pH作为影响微生物生长的关键因素，较低的pH能够显著提高乳酸菌的含量，降低氨态氮和丁酸含量，从而抑制其他有害菌的生长，提高发酵饲料的品质，如在青贮玉米秸秆发酵过程中，当pH降为3.8～4.2时，大多数菌的生长均不能进行繁殖[38]。本研究中，不同条件微生物发酵剂均能显著降低紫苏秸秆发酵饲料的pH和氨态氮∶总氮，且混合发酵处理的效果最好。顾拥建等[39]采不同处理方式对蚕豆(Viciafaba)秸秆发酵结果表明，在青贮蚕豆秸秆中添加20%麸皮+40 g·t-1乳酸菌+ 400 g·t-1纤维素酶能够显著降低pH和氨态氮/总氮的比值，改善发酵秸秆饲料的品质。本研究中，经混合发酵方法(试验组Ⅰ)处理的紫苏秸秆，其氨态氮/总氮、乙酸、丙酸和丁酸的含量均显著低于其他试验组，表明此种方法作为紫苏秸秆饲料化处理的手段具有理论和实践意义上的可操作性。

4 结论

紫苏作为我国卫生部首批公布的药食同源植物和传统的多用途经济植物，具有十分重要的实际应用价值。本研究采用市售的强微99生酵剂、粗纤维降解剂及里氏木霉发酵液混合发酵处理制备成的紫苏秸秆饲料，其发酵饲料的品质均能不同程度地得到改善，饲料中的CF、ADF、NDF及有机酸含量明显降低，CP和EE的含量明显提高。因此，可以作为紫苏秸秆饲料化利用的微生物发酵剂进行推广。且在发酵温度为30 ℃，发酵时间为7 d的条件下，在紫苏秸秆中添加20%玉米粉+1 g·kg-1强微99生酵剂+1 g·kg-1粗纤维降解剂+50 mL·kg-1里氏木霉发酵液混合处理后得到的发酵饲料品质最佳。

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