白腹鹭CO Ⅰ和Cyt b基因序列分析及鹭属系统发育研究

陈熙， 王斌， 罗旭*

(1.西南林业大学，西南地区生物多样性保育国家林业局重点实验室，昆明650224； 2. 云南高黎贡山国家级自然保护区泸水管护分局，云南泸水673100)

白腹鹭Ardeainsignis隶属于鹭科Ardeidae鹭属Ardea(Gill & Donsker，2014)，是一种体型较大的涉禽，高达127 cm，整体呈灰色，分布于尼泊尔、不丹、印度东北部和缅甸北部，我国云南西部(Hoyoetal. ，1992；韩联宪等，2015)。自1994年，白腹鹭被世界自然保护联盟(IUCN)列为濒危(EN)物种，后升级为极危(CR) 物种，全球数量不足500只(IUCN，2016)。在《中国脊椎动物红色名录》中，白腹鹭的现状是缺乏数据(DD)(蒋志刚等，2016)。对于该物种，不论是野外分布、种群现状，还是系统分类、分子生物学研究，均近于空白。

关于鹭类的系统分类研究历来不多，或者分类取样十分有限(张保卫等，2002；常青等，2003；张国萍等，2005)。鹭属内的物种归属也一直存在争议。比如，大白鹭A.alba和中白鹭A.intermedia长期以来被置于白鹭属Egretta(郑作新，1964，1994；Hermannetal. ，1972；Benetal. ，1975)，但Sibley和Monoroe(1990)根据DNA杂交研究结果，将大白鹭归入大白鹭属Casmerodius，中白鹭则独立成中白鹭属Mesophoyx。但在国际鸟类联合会(International Ornithologists Committee，IOC)的鸟类名录和目前国内普遍采用的鸟类分类系统中，大白鹭和中白鹭都置于鹭属(郑光美，2017)。对于白腹鹭，由于缺乏研究，中国鸟类分类系统一直沿用Peters的分类方式，将其置于鹭属(Peters，1945；郑作新，1964；郑光美，2017)，但尚无分子系统学的验证。

本研究根据IOC的分类系统，对鹭属鸟类进行系统发育分析。分子标记采用线粒体DNA中的细胞色素b(cytochrome b，Cyt b)基因和细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(cytochrome oxidase subunit Ⅰ，COⅠ)基因，它们都被广泛运用于鸟类分类与系统发育关系的研究(Mindell，1997；Weibel & Moore，2002；Hebertetal. ，2004；Webb & Moore，2005)。选择鹭属内7种作为内群，选择鹭科中与鹭属亲缘关系近且有相应基因序列信息的其他6属7种作为外群，构建系统发育树。

1 材料和方法

1.1 材料

2014年，在云南泸水发现的1只白腹鹭是该物种在中国分布的第一条确切记录(韩联宪等，2015)。该个体于云南野生动物园进行救助，饲养过程中死亡，我们获得少量实验样品。其余物种的Cytb和COⅠ基因序列均来自美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)(表1)。

表1 鹭科14种鸟类基因序列信息Table 1 List and gene information of 14 Ardeidae species

1.2 总DNA提取及基因扩增

取-80 ℃保存的肌肉样品提取DNA。具体操作参考生工生物工程(上海)股份有限公司的Ezup柱式动物细胞/组织基因组DNA抽提试剂盒中使用说明书的标准抽提步骤。提取DNA后经琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像仪下观察提取结果，若出现明显条带且与目的条带长度相近，则说明已成功提取出样品的总DNA，-20 ℃储存备用。

PCR反应体系为25 μL：5 μL DNA模板+12.5 μL Mix+5.5 μL ddH2O+2 μL引物(上下游引物各1 μL)，其中DNA模板和引物的密度均为10-5mol·L-1。反应在Applied Biosystems型PCR仪中进行。COⅠ基因片段扩增选用的引物对为BirdF1(TTCTCCAACCACAAAGACATTGGCAC)和BirdR1(ACGTGGGAGATAATTCCAAATCCTG)(Kerretal. ，2007)。PCR反应条件为：94 ℃ 4 min；94 ℃1 min，48 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，5个循环；94 ℃1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃7 min。Cytb基因片段扩增选用的引物对为H16067(AGCCTTCAATCTTTGGCTTACAAG)和L14731(AATTGCATCCCACTTAATCGA)(Saetreetal. ，2001)。PCR反应条件为：94 ℃ 4 min；94 ℃ 1 min，48 ℃ 1 min， 72 ℃1.5 min，35个循环；72 ℃ 7 min。在凝胶成像仪下确认PCR产物是目标条带后，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向测序。

1.3 DNA序列数据整理及分析

将测序结果用SEQMAN进行拼接并辅以人工校正。结合序列图(abI格式文件)，剪去两端信号较杂乱的序列，再查看2条链的重叠区，即在序列的内部进行人工校正。一般情况下，为保证序列的准确性，重叠区域的碱基至少≥50 bp(黄原，1998)。将拼接校正过的DNA序列在NCBI上进行BLAST相似性搜索，以确保获得的序列为目的基因片段。

运用Clustal W(Thompsonetal. ，1997)将所有物种的序列进行比对，再运用MEGA6.0对已经比对好的序列计算碱基组成情况、保守位点、变异位点、简约信息位点等，用Kimura 2-parameter(K2P)法计算遗传距离。选取除鹭属之外的其他6属7种为外群，将2段基因合并，应用MrBayes3.1(Huelsenbeck & Ronquist，2003)构建贝叶斯树，运行4个马尔可夫链，共运行5 000 000代，至平均标准离差(sd)=0.004 315(只有当sd<0.01时说明达到收敛，才可结束运行)。在FigTree 1.4.2中查看和修饰系统树。

2 研究结果

2.1 白腹鹭基因序列特征

白腹鹭Cytb基因序列共有1 163个位点(表2)。碱基含量中G最高，C最低，A+T(51.7%)高于G+C(48.3%)。嘧啶含量(39.7%)明显低于嘌呤含量(60.3%)。第一位点和第二位点的A+T均高于G+C，第三位点的A+T(48.0%)低于G+C(52.0%)。在密码子的不同位点，碱基频率有不同偏倚，第二位点上4种碱基含量较接近，偏倚程度最小；第三位点上G含量增加到46.8%，C含量只有5.2%，偏倚最突出。

白腹鹭COⅠ基因序列共有722个位点(表2)。C含量最高，G含量最低。A+T(52.5%)高于G+C(47.5%)。嘧啶含量(57.0%)高于嘌呤含量(43.0%)。第一位点的A+T(41.5%)低于G+C(58.5%)，第二位点和第三位点的A+T均高于G+C。第一位点上碱基含量比较平均；第二位点上T高达41.0%，A只有14.9%；第三位点上A含量最高，G最少，碱基偏倚现象在第三位点最明显。

2.2 鹭属基因序列特征及种间遗传距离

本研究获得白腹鹭的Cytb基因片段，合并来自NCBI的另外5种鹭属鸟类的同源区序列(NCBI中未查询到黑冠白颈鹭A.cocoi的Cytb基因信息)。经过比对排列后共有822个位点。除了中白鹭A+T的含量(49.3%)低于G+C的含量(50.7%)外，其余5种的A+T的含量均高于G+C的含量(表3)。保守位点650个，可变位点172个，简约信息位点47个，单变异位点125个。物种间序列位点变异表现为转换多于颠换，R(转换/颠换)的平均值为3.46。

表2 白腹鹭Cyt b和CO Ⅰ基因序列的各位点碱基组成Table 2 Sequence composition of Cyt b and CO Ⅰ genes of Ardea insignis

本研究获得白腹鹭的COⅠ基因片段，合并来自NCBI的另外6种鹭属鸟类的同源区序列，经过比对排列后共有599个位点。A+T的含量均高于G+C的含量(表3)。保守位点485个，可变位点111个，简约信息位点60个，单变异位点51个。物种间序列位点变异表现为转换多于颠换，R(转换/颠换)的平均值为10.04。

基于COⅠ基因计算鹭属各物种间的遗传距离，白腹鹭与草鹭A.purpurea的遗传距离最小(0.062)，与大白鹭的遗传距离最大(0.093)(表4)。

表3 鹭属7种的Cyt b和CO Ⅰ基因序列组成Table 3 Base composition of Cyt b andCO Ⅰ genes in the 7 Ardea species

表4 鹭属7种的种间遗传距离Table 4 Genetic distance between the 7 Ardea species

2.3 鹭属系统进化树

基于COⅠ和Cytb基因片段构建贝叶斯系统发育树显示(图1)，鹭属鸟类构成单系(支持率96%)。鹭属7种鸟类中，最先分化的是大白鹭，其次是白腹鹭、草鹭。苍鹭A.cinerea、大蓝鹭A.herodias、中白鹭、黑冠白颈鹭聚为一支(支持率97%)。白腹鹭位于鹭属分支内，单独聚为一支，无姐妹类群。

3 讨论

3.1 白腹鹭的线粒体基因序列特征

线粒体基因序列的碱基组成研究较多，对74种鸟类线粒体基因组序列的分析表明，密码子第二位的G、C含量波动较小，第三位的波动幅度大，这与第三位的C、T含量变化有关(高英凯等，2009)。白腹鹭Cytb和COⅠ基因序列的嘧啶和嘌呤含量有明显差异，同样是由第三位点上G、C含量变化引起，这与第三位点的变异通常不改变氨基酸编码、受选择压力小有关(钟东等，2002)。

在鸟类线粒体基因序列中，碱基组成存在一定的偏向性是普遍存在的现象(Arnaiz-Villenaetal. ，2001；Webb & Moore，2005)。偏倚情况可能因物种不同而不同，对24种雀类的研究表明，Cytb基因序列密码子第一位点出现的频率相似，第二位点G的频率明显低于其他3种碱基，第三位点偏倚G、T(Arnaiz-Villenaetal. ，2001)。在本研究中，Cytb基因序列的第一、二位点均无明显偏倚，但第三位点明显偏倚G，在该位点上的碱基偏倚与上述雀类研究相似。白腹鹭COⅠ基因序列的碱基偏倚和Cytb基因不同，第一位点没有明显的偏倚，第二位点偏倚T，第三位点偏倚A。

3.2 白腹鹭的系统分类地位

根据本文结果，鹭属7种聚为一支，该节点有较高的支持率(96%)，支持IOC分类系统中把白腹鹭、大白鹭、中白鹭均放入鹭属中的处理(Gill &Donsker，2014)，这与目前国内最新的鸟类分类系统相同(郑光美，2017)。在鹭属中，白腹鹭是较早分化的物种，遗传距离分析表明和白腹鹭亲缘关系最近的是草鹭。然而，Rasmussen和Anderton(2005)提及大嘴鹭Ardeasumatrana外部形态特征和白腹鹭最为接近，但大嘴鹭的物种地位尚不明确，抑或是白腹鹭的某些地理种群产生了形态分化，因此，白腹鹭的系统分类地位还需进一步研究确认。

图1 基于Cytb+COⅠ基因序列构建的鹭科14种鸟类的贝叶斯树
Fig.1 Bayes tree of 14 species from family Ardeidae based onCytbandCOⅠ genes

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