新型人腺病毒55型在中国10年的持续流行及其基因进化分析

毛乃颖 朱贞 雷振强 李岩 黄芳 尹洁 陈萌 向星宇 李红 唐浏英 崔爱利李忠 刘倜 许文波

102206 北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所(毛乃颖、朱贞、雷振强、李红、唐浏英、崔爱利、许文波)；050021 石家庄, 河北省疾病预防控制中心(李岩)；100013 北京市疾病预防控制中心(黄芳、陈萌)；650022 昆明, 云南省疾病预防控制中心(尹洁)；410005 长沙, 湖南省疾病预防控制中心(向星宇)；250014 济南, 山东省疾病预防控制中心(李忠、刘倜)

人腺病毒(human adenovirus, HAdV)为无包膜、二十面体对称的双链DNA病毒，基因组大小约36 kb，属于人腺病毒科(Adenoviridae)哺乳动物腺病毒属[1]。HAdV最主要的结构蛋白包括六邻体(hexon)和五邻体(penton)，其中hexon是HAdV的主要抗原蛋白，既具有共同的群特异性抗原，也具有型特异性抗原，对免疫选择压力最为敏感；每个penton由一个基座(penton base)和纤维(fiber)组成，其中fiber具有血凝特性和型特异性抗原决定位点[2]。根据HAdV生物学特性和全基因组序列及其生物信息学分析等，至今已鉴定了83种HAdV型别(http://hadvwg.gmu.edu)。

HAdV-55是中国首次鉴定的重要的呼吸道感染病原体，从2006年一起陕西省歧山县中学暴发的呼吸道感染疫情中分离到，之前该病毒一直被误认为是HAdV-11a或HAdV-11-14型[3]。通过对HAdV-55病毒全基因组序列生物信息学分析，发现该病毒是在HAdV-14的基因组骨架上与HAdV-11进行了部分Hexon基因的重组互换[4]。

HAdV-55主要引起急性呼吸道感染，临床表现为发热、咳嗽、喉咙痛等上呼吸道症状，严重会导致肺炎甚至死亡，尤其是在免疫缺陷患者中[5-6]。由HAdV-55引起的暴发流行时有报道，2004年在土耳其国际军事训练营发生数百人感染疫情，2005年在新加坡发生200多名入伍军人感染疫情，2012年和2016年分别在中国河北、西藏、云南和四川省军营引起数百名士兵感染疫情[7-10]。同时，近几年不断有HAdV-55引起的成人散发重症肺炎疫情报道，因此HAdV-55已成为全世界范围内引起公共卫生问题的重要病原体之一[11-12]。

本研究对2011—2014年从北京、河北、山东、云南和湖南5个省市的发热呼吸道患者标本中分离到的HAdV-55病毒株进行了penton base、hexon和fiber三个基因的序列测定，并与从GenBank上下载的中国其他省市HAdV-55分离株序列和以及其他国家和地区HAdV-55基因序列进行比较，并对HAdV-55在中国的流行和基因进化特征进行了初步分析。

1 材料与方法

1.1毒株信息2011—2014年，分别从北京、河北、山东、云南和湖南省等5个省市的发热呼吸道症候群患者标本中用hep-2细胞系分离到HAdV-55病毒9株(表1)。

表1 2011—2014年中国5省市分离到的HAdV-55毒株基本信息

Tab.1 Information of HAdV-55 isolates from 5 Provinces during 2011-2014 in China

1.2聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)扩增腺病毒pentonbase、hexon和fiber目的基因和序列测定取200 μl病毒悬液采用商品化核酸提取试剂(QIAamp DNA Mini Kit，Qiagen，德国)提取病毒，具体步骤详见说明书。5 μl病毒DNA提取液入到终体积50 μl的 PCR kit(金牌Mix green， 擎科，北京)反应体系中，加入终浓度0.2 μmol/L的上下游引物扩增目的基因penton base、hexon和fiber基因片段，引物详见参考文献[6]。PCR产物送北京擎科新业生物技术有限公司进行序列测定，测序结果用Sequencher 5.0软件进行核苷酸序列拼接整理。

1.3序列比对和数据库建立序列测定及基因进化分析从GenBank上下载19株中国HAdV-55病毒hexon全长基因序列，分别来自2006—2016年间云南、广东、山西、江苏、陕西、河北、重庆、四川、西藏、辽宁、天津11个省市、自治区和直辖市；以及其他12株基因序列，分别来自美国、西班牙、韩国和中国，时间从1969年至2016年，再加入本研究的9株分离株序列，共计获得40株HAdV-55病毒的hexon基因全长序列，建立hexon基因数据库。从GenBank下载全球不同时期流行的HAdV-55病毒流行株fiber基因全长序列59株，再加入本研究的9株分离株序列，共计获得68株HAdV-55病毒的fiber基因全长序列，分别来自中国、美国、韩国、西班牙，建立fiber基因数据库。从GenBank下载全球不同时期流行的HAdV-55病毒流行株penton base基因全长序列25株，再加入本研究的9株分离株序列，共计获得34株HAdV-55病毒的penton base基因全长序列，建立penton base基因数据库。用MEGA7.0软件[13]对HAdV-55毒株的hexon、fiber和penton base序列进行比对，同时加入HAdV-3(GenBank序列号：DQ099432)、HAdV-7(GenBank序列号：JX423383)、HAdV-11p(GenBank序列号：AY163756)、HAdV-14(GenBank序列号：AY803294)、HAdV-16(GenBank序列号：JN860680)、HAdV-34(GenBank序列号：AY737797)、HAdV-35(GenBank序列号：AC_000019)、HAdV-50(GenBank序列号：AY737798)原型株序列作为外部组建立核苷酸的序列比对文件。

1.4系统进化树构建和进化分析用MEGA7.0软件中邻接法(Neighbor-jioning method，NJ)和最大似然法(Maximum Likelihood method, ML)建立系统进化树，进化树可靠性估计Bootstrap值设定为1 000。使用BEAST1.8.4软件构建HAdV-55的hexon和fiber基因全长的进化树和推测病毒的核苷酸进化速率，计算方法基于用贝叶斯马尔科夫链蒙特卡洛(MCMC)分析，贝叶斯分析中使用SRD06作为核苷酸替换模式。

2 结果

2.1hexon、pentonbase和fiber基因同源性分析本研究获得的9株HAdV-55病毒株的hexon基因全长的同源性分别为99.9%～100%，与HAdV-55原型株(QS-DLL株分离于2006年，GenBank序列号：FJ643676)的核苷酸序列同源性为99.9%～100%，与最古老西班牙株(273株，于1969年分离，GenBank序列号：FJ841900)的同源性为99.8%，与HAdV-B11p的同源性为98.2%～98.3%。北京Beijing2011-031株在Hexon基因第1 629位核苷酸有T→C的无义突变。云南2株病毒在Hexon基因第1 694位核苷酸共享A→G替代，导致氨基酸发生从N→S转换，在第2 539位核苷酸共享A→T替代，导致氨基酸发生从T→S转换。本研究9株分离株的fiber基因同源性分别为99.9%～100%，与HAdV-55原型株(QS-DLL株)的同源性为99.9%～100%，与最古老西班牙273株的同源性为99.8%～99.9%，与HAdV-B14的同源性为99.4%～99.5%；云南2株病毒在585位置共享G→A无义突变，河北Hebei2012-3和Hebei2012-0045毒株在619位置共享A→C替代，导致氨基酸发生从T→P转换，北京Beijing2012-115和山东Shandong2013-7 577株在955位置核苷酸共享T→C替代，导致氨基酸发生从Y→H转换。9株病毒的penton base基因序列极为保守，仅仅在云南Yunnan2014-9705和Yunnan2014-9 754株中发现在1 506位置核苷酸共享C→T的无义突变，而与其他毒株包括HAdV-55原型株(QS-DLL株)核苷酸序列均为100%一致，所有毒株与HAdV-B14的核苷酸序列同源性为高达99.8%。

图1 腺病毒55型分离株与其代表株的hexon、fiber和penton base基因全长进化树Fig.1 Phylogenetic analysis of the HAdV-55 based on hexon, fiber and penton base gene

2.2进化树的构建基于HAdV-55病毒分离株hexon(2 841 bp)、fiber(978 bp)和penton base(1 674 bp)全长基因，分别利用NJ 法和ML 法构建系统进化树，结果显示拓扑结构基本一致，本文仅显示ML法构建结果(图1)。Hexon基因进化树显示，HAdV-55和HAdV-11p的聚集在一个分支中，而fiber和penton base基因进化树均显示HAdV-55病毒株和HAdV-14原型株聚集在同一个分支中，说明其共同的重组进化来源。1969年分离到的西班牙HAdV-55病毒株位于一个独立的进化分支，说明其与其他年代的毒株遗传距离较大。本研究获得的9株HAdV-55和从GenBank下载的国内外HAdV-55毒株在hexon基因进化树上均位于同一分支，说明HAdV-55的Hexon基因高度保守。同样，本研究的9株病毒和其他时间和地点流行株的Fiber和penton基因在进化上是高度保守的，均位于一个进化分支。然而hexon基因的MCMC进化树结果显示(图2)，HAdV-55的hexon基因在进化树具有明显的时间聚集性，1969年的西班牙273株形成一个独立分支， 1997年的美国株和2005年新加坡株形成一个独立进化分支，2001年和2002年分离到的台湾株形成一个独立分支，而2006年我国陕西省岐山县分离到的HAdV-55原型株(QS-DLL株)形成一个独立进化分支，而其他2010年以后流行的HAdV-55株与之形成一个共同进化分支。

图2 腺病毒55型分离株与其代表株的hexon基因贝叶斯进化树Fig.2 Bayesian phylogenetic tree of the HAdV-55 based on hexon gene were conducted in beast 1.8.4. Coloured branches represent different collection years of HAdV-55 viruses.)

2.3进化率和最新的共同祖先(tMRCA)分析基于hexon基因贝叶斯分析发现，非相关对数正态松弛(Uncorrelated lognormal relaxed clock model)分子钟模型最适合作为HAdV-55的hexon基因进化率计算的模型参数。根据选定的模型计算结果显示，HAdV-55毒株Hexon基因的估计核苷酸替换率约为5.228×10-5substitutions/site/year(95%可信区间为0.05～1.09×10-4)，fiber基因的估计核苷酸替换率约为1.238×10-4substitutions/site/year(95%可信区间为0.32～2.33×10-4)。HAdV-55株hexon基因起源的tMRCA可追溯到1963年(95%可信区间为1915.5～2062.0)。

3 讨论

自2006年HAdV-55首次被鉴定以来，由其导致的急性呼吸道感染公共卫生事件在中国及全世界范围内时有报道，尤其常见于兵营。同时，HAdV-55还可引发成人重症肺炎。本研究对5个省市发热呼吸道症候群患者标本中分离到HAdV-55毒株进行了hexon、fiber和penton base三个基因的序列测定，同时与2006—2016年在12个省(市、自治区和直辖市)流行的HAdV-55病毒株进行了比对，并利用多种序列分析软件进行了同源性和基因进化分析。结果显示，HAdV-55自2006年首次发现至今的10年间在我国形成了广泛传播和持续流行态势，并且已成为我国重要的呼吸道感染以及肺炎病原体之一。

基因重组是HAdV进化和免疫逃逸的一个重要特征，HAdV-55就是由HAdV-11和HAdV-14通过同源重组形成[1,14]。回顾性研究发现，以前划分为HAdV-11a的病毒分离株实际上就是HAdV-55病毒株，因此，GenBank数据库中最早的HAdV-55可以追溯到1969年的西班牙273株。基因进化分析发现，HAdV-55病毒株的hexon、fiber和penton base三个基因均高度保守，所有毒株三个基因的核苷酸和氨基酸序列同源性均>99%，在penton base和fiber基因ML进化树上，HAdV-55和HAdV-14位于同一个进化分支，而hexon基因的ML进化树显示，HAdV-55和HAdV-11位于同一个进化分支。然而，与HAdV-55原型株(QS-DLL)比较，2011年北京和2014年云南分离的毒株hexon基因均有独特的核苷酸替代，但由于基因同源性较高，在ML进化树中分支并不明显，进一步构建MCMC进化树，结果中较为清晰的显示了基于hexon基因的进化时间聚集特征，不同时间来源的分离株聚集在不同的进化分支中，提示HAdV-55在进化上有一定的时间聚集进化趋势。

本研究发现， HAdV-55病毒 hexon和fiber基因的核苷酸进化率分别为5.228×10-5和1.238×10-4substitutions/site/year，要远远低于其他B属HAdV，如HAdV-3和HAdV-7病毒 Hexon和fiber基因的核苷酸进化率(分别为0.234×10-3和1.085×10-3、0.132×10-3和1.107×10-3、substitutions/site/year)[15]，结果提示HAdV-55可能在进化上更加保守稳定。但考虑到本研究涉及的hexon基因毒株多数来自近10年，且70%以上的毒株来自中国，其他毒株仅仅来自韩国、美国和西班牙3个国家，因此有可能会低估了HAdV-55的进化速率。目前，随着腺病毒全基因组测序技术的发展和成熟，来自世界不同国家地区和不同年代HAdV-55基因数据的不断积累，将会更加准确的预测HAdV-55进化速率和时间地理进化趋势，为HAdV-55疫苗的相关研究和预防控制提供基础数据和科学基础。

综上所述，本研究通过基于hexon、fiber和penton base基因的生物信息学分析，对过去10年间我国HAdV-55病毒株进行了流行和基因进化特征分析，报道了HAdV-55的进化趋势和进化速率；尽管本研究结果显示HAdV-55的三个主要的结构蛋白在进化上极为稳定，但仍然在选择压力下缓慢进化，具有一定的时间进化趋势。为了更好应对由HAdV-55导致的呼吸道感染暴发或者散发公共卫生事件，必须建立连续有效的监测体系，掌握其在我国的进化及流行动态。同时，考虑到HAdV-55暴发流行感染人群的特殊性，对研制HAdV-55疫情应急疫苗相关研究也应获得重视。

利益冲突无

参考文献

[1] Davison AJ, Benko M, Harrach B. Genetic content and evolution of adenoviruses[J]. J Gen Virol， 2003, 84(Pt 11): 2895-2908. DOI: 10.1099/vir.0.19497-0.

[2] Chroboczek J, Ruigrok RW, Cusack S. Adenovirus fiber[J]. Curr Top Microbiol Immunol， 1995, 199(Pt1):163-200.

[3] Yang Z, Zhu Z, Tang L, et al. Genomic analyses of recombinant adenovirus type 11a in China[J]. J Clin Microbiol, 2009,47(10):3082-3090. DOI: 10.1128/JCM.00282-09.

[4] Seto, D, Jones MS, Dyer DW, et al. Characterizing, typing, and naming human adenovirus type 55 in the era of whole genome data[J]. J Clin Virol, 2013, 58(4): 741-742. DOI: 10.1016/j.jcv.2013.09.025.

[5] Sun B, He HY, Wang Z, et al. Emergent severe acute respiratory distress syndrome caused by adenovirus type 55 in immunocompetent adults in 2013: a prospective observational study[J]. Crit Care, 2014, 18(4): 456. DOI: 10.1186/s13054-014-0456-6.

[6] Chen M, Zhu Z, Huang F, et al. Adenoviruses associated with acute respiratory diseases reported in Beijing from 2011 to 2013[J]. PLoS One, 2015, 10(3): e0121375. DOI: 10.1371/journal.pone.0121375.

[7] Chmielewicz B, Benzler BJ, Pauli G, et al. Respiratory disease caused by a species B2 adenovirus in a military camp in Turkey[J]. J Med Virol, 2005, 77(2): 232-237. DOI: 10.1002/jmv.20441.

[8] Kajon, AE, Dickson LM, Metzgar D, et al. Outbreak of febrile respiratory illness associated with adenovirus 11a infection in a Singapore military training cAMP[J]. J Clin Microbiol, 2010, 48(4): 1438-1441. DOI: 10.1128/JCM.01928-09.

[9] Salama M, Amitai Z, Amir N, et al. Outbreak of adenovirus type 55 infection in Israel[J]. J Clin Virol, 2016, 78: 31-35. DOI: 10.1016/j.jcv.2016.03.002.

[10] Wang W, Liu Y, Zhou Y, et al. Whole-genome analyses of human adenovirus type 55 emerged in Tibet, Sichuan and Yunnan in China, in 2016[J]. PLoS One, 2017, 12(12): e0189625. DOI: 10.1371/journal.pone.0189625.

[11] Chen Y, Liu FH, Wang CB, et al. Molecular Identification and Epidemiological Features of Human Adenoviruses Associated with Acute Respiratory Infections in Hospitalized Children in Southern China, 2012-2013[J]. PLoS One, 2016, 11(5): e0155412. DOI: 10.1371/journal.pone.0155412.

[12] Tan DY, Zhu HD, Fu YY, et al. Severe Community-Acquired Pneumonia Caused by Human Adenovirus in Immunocompetent Adults: A Multicenter Case Series[J]. PLoS One, 2016, 11(3): e0151199. DOI: 10.1371/journal.pone.0151199.

[13] Kumar S, Stecher G, Tamura K. MEGA7: Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets[J]. Mol Biol Evol, 2016, 33(7):1870-1874. DOI: 10.1093/molbev/msw054.

[14] Walsh, MP, Seto J, Jones MS, et al. Computational analysis identifies human adenovirus type 55 as a re-emergent acute respiratory disease pathogen[J]. J Clin Microbiol, 2010, 48(3): 991-993. DOI: 10.1128/JCM.01694-09.

[15] Lin YC, Lu PL, Lin KH, et al.Molecular epidemiology and phylogentic analysis of human adenovirus caused an outbreak in Taiwan during 2011[J].PloS One,2015,10(5):e0127337.DOI:10.1371/journal. pone. 0. 127377.