病毒学实验室资质认定中非标方法的确认研究

李洁 何小周 杨梦婕 马学军 武桂珍

102206 北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所

中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所(以下简称病毒病所)担负着研究新的实验方法，建立与制定标准，技术指导全国病毒病防控工作等任务。有些实验方法需要提升到国家标准、行业标准高度。其中一些非标方法(自制方法)相比于国标方法、行标方法具有独特的优势。通过检验检测机构资质认定工作(又称实验室资质认定)，可以将这些成熟的方法通过资质认定的法定程序予以确认，进而转化成为本所标准，使用该方法得到的检测结果就具备了一定的法律效力[8,13]。

1 方法确认的依据

按照实验室资质认定评审准则的要求[1-4]，对非标方法进行技术确认的主要原则应包含：(1)使用参考标准或标准物质进行比较；(2)与其他方法所得的结果进行比较；(3)实验室间检测结果的比对；(4)对影响结果的因素作系统性评审；(5)根据对实验方法理论原理和实践经验的科学理解，对所得结果不确定度进行评定。

非标方法的确认除其他程序完备外，一般需要有三个或以上的比对试验，可以有以下几种办法：1)组织学术评审会，邀请专家，通过学术评审确定方法的可行性、适应性和有效性。2)实验室内方法确认(in-house method validation):同一实验室内，在合理的时间间隔内，用一种方法在预定条件下对相同或不同测试样品进行的分析实验。亦可由本室不同人员通过留样再测，进行不同批次的实验比对[5-7,11]。3)实验室间方法确认(inter-laboratory method validation)是指在两个或多个实验室之间实施的方法确认。各实验室依照预定条件用相同方法对相同样品进行测定。包括在本所或外所不同的实验室对该方法进行重复，以实现在不同地点的实验比对[5-7,11]。4)与其他标准方法比对。5)与标准品检测结果比对。结合资质认定《检验检测机构资质认定评审准则》(国认实[2016]33号)[3]和国际标准《检测或校准实验室能力认可准则》ISO/IEC：17025的规则要求，本研究就比对方法进行梳理[5-7]。需要说明的是，下述介绍的各种比对结果评价中，要用到一个重要的参数是测量不确定度，而对于病毒学方法的的评价指标主要是特异性，稳定性和可靠性等，难以套用测量不确定度的计算公式，病毒学方法应该依照资质认定的原则框架进行比对试验，但具体判定规则应按照本专业规则和图表进行判定和表达。

2 比对方法(试验)[9-14]

2.1人员比对在相同的环境条件下，采用相同的检测方法、相同的检测设备和设施，由不同的检测人员对同一样品进行检测的试验。以参与比对试验人员中具有较高准确度一方的测定值作为参考值，比对试验结果进行评价。

2.2方法比对在环境条件相同的前提下，由相同的人员采用不同的检测方法对同一样品进行的检测,对试验结果进行评价。

2.3仪器比对在相同的环境条件下、使用相同的方法、由相同的检测人员采用不同的仪器设备对同一样品进行检测的试验。

2.4留样再测在尽可能相同的环境条件下，采用相同的检测方法、相同的检测设备和设施，由相同的检测人员对已完成检测的样品在其留样保存期间进行再次检测的试验。

3 实证案例

以“RT-RAA法检测 EV71/ CA16等病毒”方法为例，说明方法确认研究的要素。结合具体方法的实际情况，对原方法做适当验证，补充和修正。

按照《检验检测机构资质认定评审准则》(国认实[2016]33号)4.5.14要求。 按照病毒学实验室质量体系文件《检测方法控制程序》的要求，进行比对试验验证，具体使用的方法是留样再测，人员比对。通过比对确认该方法的敏感性、特异性、稳定性，可靠性符合预期。“RT-RAA法检测 EV71/CA16等病毒”方法采用了以下形式进行比对试验验证：由不同检测人员非同一日对留样进行3次实验操作，3次实验结果均为阴性对照无扩增曲线出现，阳性对照和样品有明显的扩增曲线，因此3次重复实验样品结果均判读为CA16。通过比对确认该方法的特异性、稳定性和可靠性符合预期。

4 确认后的方法

调整后的“RT-RAA法检测 EV71/CA16等病毒”方法[8]从形式上提升为病毒病所所内标准；程序上符合了实验室资质认定的方法确认程序；内容上增加了技术要求、结果分析、检验规则、判定规则等条款。以下引用修改后的该标准：

——————中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所《标准》。标准编号：Q/IVDC024005-2017，标准名称：《RT-RAA法检测 EV71/ CA16等病毒》，发布时间2017年12月25日。

前言

关于本标准的基本概况：手足口病是人肠道病毒引起的一种儿童常见传染病。引发手足口的病毒以肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型为主。传统的检测方法如多重PCR法和定量PCR法对硬件设备和操作人员的技术要求较高，且成本也高，故建立该快速准备易普及的检测方法，对现场突发事件及实验室大量检测任务具有重大意义。根据《中华人民共和国标准化法》、《中华人民共和国产品质量法》特制订本产品标准作为该检测方法的质量依据。

本标准由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所中心实验室提出

本标准主要起草人：马学军，王佶，杨梦婕，何小周

1 范围

本标准建立了EV71/CA16等病毒的等温核酸扩增方法，提高病原微生物快速检测能力。

本标准适用于经过生物安全培训的操作人员进行EV71/CA16等病毒感染病例标本的检测。

2 规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

Use of a rapid reverse-transcription recombinase aided amplificationassay for respiratory syncytial virus detection. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease,chenChen,xuejunMa,et al. Available online 14 October 2017.

3 定义和术语

下列术语和定义适用于本标准。

重组酶介导等温核酸扩增技术(Recombinase Aided Amplification，RAA)是一种利用重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶在39 ℃等温条件下对核酸进行扩增的技术，使用该技术在短时间内即可将目的基因扩增放大到几百万倍，达到可以用仪器检测到的水平。

逆转录(Reverse Transcription，RT)提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA为模板，利用引物和逆转录酶反转录成cDNA。

柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16，CA16)是一种肠道病毒，导致手足口病的主要病原体之一。

肠道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)是一种肠道病毒，引起婴幼儿手足口病主要病原体之一。

4 技术要求(检测方法)

4.1 试剂耗材及主要仪器设备

Qiagen QIAamp Viral RNA Mini Kit(catalog #52904)；RT-RAA核酸扩增试剂盒(荧光法)；DEPC处理水(无RNA酶和DNA酶)；1.5 ml离心管,0.2 ml PCR反应管；200 μl、100 μl、10 μl带滤芯的TIP；奇天基因荧光基因检测仪(QT-RAA-F7200)；

RAA 8连管混匀仪(RAA-B3208)；恒温核酸扩增仪(RAA-F1620)。

4.2 操作步骤

4.2.1 病毒核酸提取(具体操作见试剂盒说明书)

4.2.2 开启荧光基因检测仪，温度调节至39 ℃

4.2.3 按反应体系配制表配制反应体系(单个样品/反应)；混匀并离心；

4.2.4 将混合好的上述溶液加入到反应干粉管；向反应干粉管的盖子上加入2.5 μl醋酸镁；向上述溶液中加入2 μl样本RNA，充分混匀并离心收集；

组分用量(μl)反应缓冲液25正向引物(10μmol/L)21反向引物(10μmol/L)21探针(10μmol/L)06双蒸水157

4.2.5 将反应管放入荧光基因检测仪反应30 min进行扩增，并实时观察结果。反应程序：39 ℃，30 min；

5 结果分析

空白对照和阴性对照均无扩增曲线出现，阳性品有明显的扩增曲线。

6 检验规则

需满足以下质量控制要求，检验有效：空白对照阴性，阴性对照阴性，阳性对照阳性。

7 判定规则

从扩增曲线判断，有明显扩增曲线的样品判定为EV71或者CA16阳性。

综上所述，通过建立、验证与确认方法，以及对“RT-RAA法检测 EV71/ CA16等病毒”方法的实证研究，探索了病毒学实验室基于实验室资质认定条件下非标方法建立、确认、验证、核查等一系列问题，同时尝试将非标方法进行标准化改造，以拓展非标方法的使用范围，提升其严谨性，为病毒学实验室非标方法的确立与标准化提供了具体的实证样本。

利益冲突：无

参考文献

[1] 中华人民共和国认证认可条例(国务院令第666号).

[2] 检验检测机构资质认定管理办法(国家质量监督检验总局令第163号).

[3] 检验检测机构资质认定评审准则(国认实[2016]33号).

[4] 关于实施《检验检测机构资质认定管理办法》若干意见(国认实[2015]49号).

[5] 中国合格评定国家认可委员会．检测或校准实验室能力认可准则[S].CNAS/CL01∶2006(等同于ISO/IEC17025).

[6] 中华人民共和国国家标准质量管理体系基础和术语GB/T19000—2008/ISO9000—2005[M].北京：中国标准出版社.

[7] 通用计量术语及定义[S].JJF1001-1998.

[8] 武桂珍．《高致病性病原微生物危害评估指南》[M].北京：北京大学医学出版社，2008．

[9] 中国合格评定国家认可委员会,实验室认可准则在微生物实验室应用说明[S].CNAS/CL09:2006.

[10] 中国合格评定国家认可委员会．实验室认可准则在化学领域的应用说明[S].CNAS/CL09:2012．

[11] ISO/IEC指南99：方法确认—2007，2.45.

[12] ISO/IEC指南99：方法验证—2007，2.44.

[13] 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所《质量手册》,《程序文件》.

[14] 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所《作业指导书》.