群多普利对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用研究

周刚，王佳君

脑缺血再灌注损伤是一个复杂的病理生理过程，最近研究发现，脑血流中断和再灌注使脑的细胞产生损伤是一个快速的级联反应，这个级联反应包括许多环节，如能量障碍、细型，上海博讯医疗设备厂；BI-2000图像分析系统：成都泰盟科技有限公司；酶标仪：Genios TECAN公司，奥地利。

1.4 实验方法

1.4.1 分组及给药 将健康雄性SD大鼠随机分成模型组、假手术组、群多普利低剂量组（5 mg/kg）、群多普利高剂量组（10 mg/kg），12只/组；腹腔注射给药，模型组、假手术组给予同剂量的生理盐水，每天1次，连续给药6 d。第6天给药后1 h建立缺血再灌注模型。

1.4.2 脑缺血/再灌注动物模型的制备 采用改良ZeaLonga's法制作大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MACO）模型[2]。大鼠用10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉，仰卧固定，颈部正中线切口，沿胸锁乳突肌内缘钝性分离肌肉和筋膜，直到分离出左侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，用动脉夹暂时夹闭颈内动脉，结扎颈外动脉近心端及颈总动脉，然后在距颈总动脉近分叉3～4 mm处剪口，按体重选取适当直径自制线栓（参照范围：180～230 g：0.235 mm；230～260 g：0.26 mm；＞260 g：0.28 mm）自切口轻轻插入，插入深度（从颈内、外动脉分叉处计起）约为18～20 mm，固定鱼线，缝合皮肤。缺血2 h后，将栓塞线向外轻轻拔出10 mm左右，抽拉出至颈内、外动脉分叉进行复灌。假手术组按上述方法，分离颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉后，插入栓塞线仅至颈内、外动脉分叉处，而不阻塞大脑中动脉。复灌24 h进行后续试验。

1.4.3 模型的鉴定 模型制备过程中，应用SA5600自动血流变仪检测大鼠大脑中动脉血流改变；如图1所示，大鼠MCAO模型可显著减少大脑中动脉血流量；复灌后，大脑中动脉血流量基本恢复；大鼠清醒后，观察MCAO后的神经行为特征的变化，即出现下面体征者表明模型制作成功[2]：①大鼠大脑中动脉栓塞侧（本实验栓塞右侧）出现Horner征，表现为瞳孔缩小，眼裂变小。②躯体向对侧屈曲，大鼠不能充胞酸中毒、兴奋性氨基酸释放增加、细胞内钙失稳态、自由基生成、凋亡基因激活等。这些环节互为因果，彼此重叠，并相互联系，形成恶性循环，最终导致细胞凋亡或坏死[1]。近年来研究表明，炎症在脑缺血再灌注损伤中起着重要作用，脑缺血再灌注后内皮细胞炎症反应使血脑屏障受损，加重了脑损害及脑水肿。近期研究表明，肾素-血管紧张素转换酶抑制剂（angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI）类药物具有抗炎[2]、抑制组织纤维素样坏死、抑制金属基质蛋白酶（matrix metallopeptidase 9，MMP-9）的活性等药理作用[3]，因此研究抑制脑缺血后炎症反应，可能成为治疗脑缺血损伤的有效方法。本实验采用大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，探究群多普利对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及其对炎症反应相关因子白细胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-10表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性健康SD大鼠48只，体重220～260 g，购于华中科技大学同济医学院实验动物中心。动物许可证号：SCXK（鄂）2010-0007。大鼠自由进食、饮水，适应性饲养7 d后进行实验，所有动物实验操作均符合华中科技大学动物伦理委员会有关条例规定。

1.2 药品与试剂 群多普利购自美国的USP对照品（批号：FOH140），2，3，5-三苯基氯化四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）购于中国医药（集团）上海化学试剂公司；IL-1β及IL-10免疫酶联吸附法（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）检测试剂盒购于美国R&D公司。

1.3 主要实验仪器 SA5600自动血流变仪：北京赛科西德公司；pH计：DELTA320，梅特勒（上海）有限公司；台式高速低温离心机：TGL-16A，长沙平凡仪器仪表公司；恒温水槽：SSW分伸展左前肢，提尾时躯体向左转，右侧前后肢外展，左侧前后肢松软屈曲。③运动时出现追尾征：运动时躯体向一侧倾斜、旋转。假手术组会出现Horner征，但无左前肢屈曲和追尾征。④缺血脑组织切片，TTC染色，可见苍白色的缺血区域。

1.4.4 神经症状评分标准 大鼠清醒后，观察其行为学变化，神经症状按Longa 5分制评分[2]。评分标准：无神经损伤，0分；不能完全伸展左侧肢体，前肢为甚，1分；向左转圈，2分；行走时向左侧倾倒，3分；不能自发行走，意识昏迷，4分。分数越高，表示动物神经功能障碍越严重。

1.4.5 TTC染色及脑梗死体积的测定 大鼠MCAO 2 h再灌注24 h后，迅速断头取脑，沿冠状面切成6片（每片约2 mm），立即置于2%TTC磷酸盐缓冲液中，37℃避光温浴30 min。取出脑片置10%福尔马林液中固定，正常脑组织为玫瑰红色，梗死部位为白色。应用BI-2000图像分析系统分析计算脑梗死体积占全脑体积的百分比。

1.4.6 ELISA检测脑组织IL-1β及IL-10含量 大鼠MCAO 2 h再灌注24 h后，迅速断头取脑，立即置于冰盘上，取梗死交界区脑组织，用冰冻生理盐水制备20%脑匀浆，2500 r/min离心10 min，取上清，-80℃保存用于IL-1β及IL-10含量的测定，具体操作步骤按IL-1β及IL-10 ELISA检测试剂盒说明书进行，各因子含量以每克蛋白所含细胞因子皮克数表示，即pg/g（pro）[4-5]。

1.5 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件分析数据，所有数据以表示，多组资料采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 群多普利对缺血再灌注损伤大鼠神经功能评分的影响 缺血再灌注损伤大鼠神经功能评分为（2.67±0.21）分；群多普利低剂量和高剂量组大鼠神经功能评分分别降至（1.75±0.25）分（P＜0.05）及（1.60±0.39）分（P＜0.05）（表1）。

2.2 群多普利对缺血再灌注损伤大鼠脑梗死体积的影响 群多普利低剂量和高剂量均可显著降低大鼠脑梗死体积百分比（表2和图2）。

2.3 群多普利对缺血再灌注损伤大鼠脑组织IL-1β及IL-10含量的影响 缺血再灌注损伤大鼠脑梗死交界区脑组织的IL-1β及IL-10含量分别为（6.77±0.94）pg/g（pro）及（8.68±0.78）pg/g（pro）；群多普利低剂量组和高剂量组大鼠脑组织IL-1β的含量分别下降至（4.53±1.06）pg/g（pro）（P＜0.05）及（4.01±0.89）pg/g（pro）（P＜0.01）；群多普利高剂量使大鼠脑组织IL-10的含量增加至（12.83±0.92）pg/g（pro）（P＜0.05）。

图1 大鼠缺血前后及再灌注后大脑中动脉血流改变

表1 各组大鼠神经神经功能损伤评分及脑梗死体积

3 讨论

本实验结果表明，群多普利可显著减小大鼠脑缺血再灌注损伤所致的脑梗死体积，改善神经功能预后。

缺血再灌注损伤涉及极其复杂的病理生理过程，其中各个环节、各种影响因素间的相互作用尚未完全阐明。目前认为，其主要机制包含兴奋性氨基酸毒性、自由基及脂质过氧化、线粒体功能障碍、Ca2+超载及由上述因素引起的一系列致炎因子（IL-1、肿瘤坏死因子-α、IL-6等）和抗炎症因子（IL-10、转化生长因子、神经生长因子等）表达失衡。上述各环节可以相互影响，相互促进，导致病情的进一步恶化。脑缺血损伤的最终发展方向主要是炎症反应引起的细胞坏死和凋亡。因此，控制脑缺血过程中的炎症反应，阻断恶性循环的关键环节，对改善脑缺血症状及预后有重要意义。

表2 群多普利对缺血再灌注损伤大鼠脑组织IL-1β及IL-10含量的影响

图2 群多普利对缺血再灌注损伤大鼠脑梗死体积的影响

IL-1β为一种致炎细胞因子，广泛参与了人体组织破坏、水肿形成等多种病理损伤过程。研究表明，IL-1β可加重脑缺血引起的脑水肿及中性粒细胞的浸润[6]，IL-1β受体拮抗剂IL-1RA可减少MCAO大鼠脑梗死[7]；在脑缺血损伤的炎症反应中，效应细胞在产生促炎细胞因子的同时，也会合成分泌大量的抑炎细胞因子，两者之间互相作用，决定着炎症反应的发展方向。IL-10是Th2型细胞因子中最重要的抗炎细胞因子，在细胞因子网络中发挥着极其重要的作用，其可下调主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）-Ⅱ型抗原、共刺激分子B7和黏附分子的表达，抑制抗原的递呈过程，直接抑制T细胞的增殖；此外，IL-10能抑制炎症细胞因子如IL-1、IL-6、IL-8和肿瘤坏死因子-α及一氧化氮、自由基、前列腺素等炎性调节因子的分泌，进而保护宿主免受过度的免疫及炎症反应。已有研究表明，IL-10可显著减少大脑中动脉急性闭塞所致的脑梗死的体积[8]。

研究表明，在脑缺血再灌注损伤过程中血管紧张素Ⅱ作为一个致炎因子发挥着重要作用，动物实验表明，短暂性全脑缺血后及给予血管紧张素Ⅱ可增加脑水肿程度[9]，给予血管紧张素受体阻滞剂或血管紧张素Ⅱ抗体可以显著减少脑梗死面积、提高神经功能预后[10-12]，然而，其具体机制尚不清楚。本实验发现，缺血再灌注损伤大鼠脑组织内IL-1β及IL-10含量均显著增加，IL-1β的增加提示缺血再灌注损伤可诱发炎症反应导致神经元损伤；IL-10的增加提示可能存在一种内源性的保护机制；显而易见，此时的致炎因子与抗炎因子处于失衡状态；给予5 mg/kg及10 mg/kg群多普利均可明显改善脑缺血再灌注大鼠的神经功能评分，减少脑梗死体积，同时抑制IL-1β的分泌，高剂量的群多普利（10 mg/kg）可进一步提高IL-10的分泌。上述结果提示，低剂量的群多普利主要是抑制炎症因子IL-1β的分泌，而较高剂量时既可抑制炎症因子IL-1β的分泌，又可增加抗炎因子IL-10的分泌。

本实验结果初步提示，在脑缺血再灌注损伤雄性大鼠中，群多普利可能通过调节IL-1β及IL-10的分泌，重建促炎因子与抗炎因子之间的平衡，从而起到神经保护作用。但是本实验尚存在一定的局限性：①为了排除雌激素对脑缺血的保护作用，本实验仅选取雄性大鼠为研究对象；②有关群多普利对炎性因子的调控机制尚有待进一步探究。

参考文献

[1]方舒东，朱也森. 脑缺血再灌注损伤的病理生理研究进展[J]. 医学综述，2006，12（18）：1114-1116.

[2]BENICKY J，SÁNCHEZ-LEMUS E，PAVEL J，et al. Anti-inflammatory effects of angiotensin receptor blockers in the brain and the periphery[J]. Cell Mol Neurobiol，2009，29（6-7）：781-792.

[3]TANAKA H，TAKAI S，JIN D，et al. Inhibition of matrix metalloproteinase-9 activity by trandolapril after middle cerebral artery occlusion in rats[J].Hypertens Res，2007，30（5）：469-475.

[4]付怀栋，林福军，潘永进，等. 甘草酸二胺对大鼠脑出血后脑水肿的疗效研究[J]. 海南医学，2012，23（2）：21-23.

[5]BRUGGINK K A，JONGBLOED W，BIEMANS E A，et al. Amyloid-β oligomer detection by ELISA in cerebrospinal fluid and brain tissue[J]. Anal Biochem，2013，433（2）：112-120.

[6]LIU H，UNO M，KITAZATO K T，et al. Peripheral oxidative biomarkers constitute a valuable indicator of the severity of oxidative brain damage in acute cerebral infarction[J]. Brain Res，2004，1025（1-2）：43-50.

[7]STROEMER R P，ROTHWELL N J. Cortical protection by localized striatal injection of IL-1ra following cerebral ischemia in the rat[J]. J Cereb Blood Flow Metab，1997，17（6）：597-604.

[8]DE BILBAO F，ARSENIJEVIC D，MOLL T，et al.In vivo over-expression of interleukin-10 increases resistance to focal brain ischemia in mice[J]. J Neurochem，2009，110（1）：12-22.

[9]HOSOMI N，MIZUSHIGE K，KITADAI M，et al.Induced hypertension treatment to improve cerebral ischemic injury after transient forebrain ischemia[J].Brain Res，1999，835（2）：188-196.

[10]YAMAKAWA H，PHILLIPS M I，SAAVEDRA J M. Intracisternal administration of AngiotensinⅡ AT1 receptor antisense oligodeoxynucleotides protects against cerebral ischemia in spontaneously hypertensive rats[J]. Regul Pept，2003，111（1-3）：117-122.

[11]LIU H Q，WEI X B，SUN R，et al. Angiotensin Ⅱstimulates intercellular adhesion molecule-1 via an AT1 receptor/nuclear factor-kappaB pathway in brain microvascular endothelial cells[J]. Life Sci，2006，78（12）：1293-1298.

[12]WAKAYAMA K，SHIMAMURA M，SUZUKI J I，et al. Angiotensin Ⅱ peptide vaccine protects ischemic brain through reducing oxidative stress[J].Stroke，2017，48（5）：1362-1368.