敲除LSD1基因对人慢性髓系白血病K562细胞周期的影响

任思蕊, 王冰蕊, 郭 青, 冯甜甜, 王 鼎, 高 洁, 石莉红

中国医学科学院, 北京协和医学院血液病医院(血液学研究所), 实验血液学国家重点实验室, 天津 300020

表观遗传是在DNA序列信息不变的情况下，细胞内部发生的可遗传改变，方式主要有DNA和组蛋白的修饰、染色质的重塑等[1]。表观遗传学参与了肿瘤的发生发展，在已有的白血病研究中，发现许多原癌基因和抑癌基因的启动子区域CpG岛发生异常的甲基化修饰，例如ABLl(P1)基因[2]、ECAD基因[3]、EphA3基因[4]等。但是关于组蛋白修饰参与白血病发生的研究较少。

在构成染色质的组蛋白上，可以发生甲基化、乙酰化、泛素化等多种修饰，进而调控基因表达[5]。LSD1是组蛋白去甲基酶，它催化组蛋白赖氨酸特异的去甲基反应从而完成对组蛋白的修饰，抑制靶基因的转录[6]。LSD1在哺乳动物造血系统中发挥着重要的生理作用。LSD1敲除的小鼠胚胎发育7.5d死亡，通过对LSD1条件敲除小鼠模型的研究显示，LSD1在造血发生过程中高表达，并且对红系、巨核系、粒系细胞的终末分化必不可少[7]。在AML细胞中，通过抑制LSD1的活性，降低了AML细胞的集落形成能力，并促进细胞凋亡[8]，这暗示LSD1可能通过组蛋白修饰参与白血病的发展。

在我们的前期实验中，已经利用CRISPR/Cas9技术构建了人慢性髓系白血病K562的LSD1基因敲除株，发现LSD1的敲除显著抑制了CD235a的表达，并且显著减慢了K562细胞的增殖速度[9]。为了探究LSD1敲除后K562细胞增殖变慢的原因，本研究利用流式细胞仪检测细胞凋亡的改变以及细胞周期的变化，发现敲除LSD1后，不影响K562细胞凋亡水平；但是细胞周期发生明显改变，阻滞在G0/G1期的细胞变多，S期和G2/M期的细胞变少，进而导致细胞的增殖变慢。

1 材料方法

1.1 仪器与试剂

流式细胞仪LSR II(美国BD公司)；K562细胞系原购自美国ATCC公司，后经由本实验室保存； K562细胞LSD1纯合敲除株(LSD1-/-)、杂合敲除株(LSD1+/-)由本实验室构建，传代并冻存；细胞培养所用的胎牛血清、L-谷氨酰胺、RPMI 1640基础培养液、青霉素-链霉素抗生素、丙酮酸钠等细胞培养相关试剂购自美国Gibco公司; 细胞凋亡检测试剂盒购于美国BD公司。

1.2 细胞培养

K562细胞使用的基础培养液为RPMI 1640，添加1%的青霉素-链霉素、1%的L-glutamine以及10%的胎牛血清，K562细胞培养条件为37℃恒温、5% CO2孵箱培养，培养密度为1×105个/mL，细胞密度达到1×106个/mL时进行细胞传代。

1.3 K562细胞凋亡检测

试剂稀释：细胞凋亡检测试剂盒中提供的5×Binding Buffer，使用无菌PBS稀释至1×Binding Buffer，4℃预冷。

K562细胞的准备：K562细胞计数取1×106个细胞，300 g离心5 min，弃上清，用PBS缓冲液清洗1遍，吸弃上清后使用100 μL 1×Binding Buffer将细胞重悬。

细胞染色：加入5 μL的Annexin V-FITC混匀后，避光，室温孵育15 min；上机检测前5 min再加入5 μL的PI染料并补加200 μL的1×Binding Buffer。

制备好的细胞悬液使用流式细胞仪LSRⅡ检测细胞凋亡比例，使用FITC和PI两个通道，检测结束后用软件FlowJo7.6.1进行分析，流式细胞仪检测显示的细胞分布在四象限内，Annexin V-/PI-为活细胞，Annexin V+/PI-和Annexin V+/PI+为早期凋亡以及晚期凋亡的细胞。

1.4 细胞周期检测

细胞固定：收集细胞并用PBS洗涤，300 g离心5 min后弃掉上清；每组细胞中加入1 mL 70%乙醇，混匀后4℃固定24 h以上。

细胞染色与检测：取固定完毕的细胞，使用PBS清洗一遍，300 g离心5 min后弃掉上清。重新加入50 μL PBS及3 μL核糖核酸酶，室温孵育10 min后加入150 μL PI的PBS溶液，室温避光染色10 min；染色后使用LSR II流式细胞仪检测，并使用ModFit程序分析G0/G1，S和G2/M期细胞比率。

1.5 统计学分析方法

2 结果与分析

2.1 LSD1基因敲除对K562细胞增殖周期的影响

前期研究中发现，敲除LSD1基因后K562细胞增殖受到显著抑制，LSD1+/-细胞株增殖速度显著慢于WT组，LSD1-/-细胞株的增殖速度与WT组相比，差异极显著[9]。为了进一步探究敲除LSD1基因后K562细胞增殖受到显著抑制的原因，本实验检测了K562细胞的增殖周期，细胞周期中的G0和G1期是DNA合成前期，进入S期后DNA开始合成，G2期DNA合成结束。将培养中的K562细胞野生型、LSD1+/-、LSD1-/-细胞株同时进行PI染色，PI可以与DNA结合，其荧光强度直接反映了细胞内DNA含量(图1A)。分析3株细胞所处细胞周期内各阶段细胞比例，结果显示敲除LSD1后，被阻滞在G1期的细胞比例升高，然而在S期的细胞比例明显降低，进入G2/M期的细胞比例也降低(图1B)。以上结果表明，敲除LSD1基因后K562细胞的增殖周期被阻滞在G0/G1期，进入DNA复制期的细胞减少，从而使进入分裂状态细胞比例减少，细胞增殖减慢。

图1 LSD1敲除对K562细胞增殖周期的影响Fig.1 Effects of LSD1 knockout on the cell cycle of K562 cells.A.PI染色以及流式细胞仪分析各组细胞的细胞周期分布比例;B.统计学分析各组细胞的细胞周期分布比例。*表示P<0.1水平差异显著，**表示P<0.01水平差异显著，***表示P<0.001水平差异显著。

2.2 LSD1基因敲除对K562细胞凋亡水平的影响

为了探究LSD1+/-和LSD1-/-细胞株增殖减慢的原因，除细胞周期改变外，是否由于敲除基因LSD1影响细胞凋亡水平所引起，本实验将培养中的K562细胞野生型、LSD1+/-、LSD1-/-细胞株同时进行细胞凋亡检测，并使用软件FlowJo7.6.1分析，Annexin V-/PI-为活细胞，Annexin V+/PI-和Annexin V+/PI+为早期凋亡以及晚期凋亡的细胞，统计分析凋亡细胞的总比率，结果显示: 敲除LSD1后，不影响K562细胞凋亡水平(图2)。

3 讨论

LSD1又名KDM1A，是胺氧化酶家族中的一员，其C端具有AOL结构域，主要包括FAD(黄素腺嘌吟二核苷酸)结合结构域和催化活性中心两个部分，在FDA的参与帮助下，LSD1可以与组蛋白底物结合，特异催化组蛋白H3K9me1/2和H3K4me1/2去甲基化[10～12]。

研究表明，组蛋白修饰在生理以及病理状态下的造血过程中均发挥核心作用。在急性白血病患者的基因组中，由于染色质修饰基因的各种后天病变，或其表达水平的变化，表观遗传学的整体状态发生明显改变[13]。在多种血液系统淋系和髓系恶性肿瘤中，组蛋白-赖氨酸-N-甲基转移酶EZH2被证明发生了突变[14]；组蛋白甲基转移酶DOT1L的小分子抑制剂显示出对MLL(混合谱系白血病)的临床治愈性[15,16]；另外，组蛋白去甲基转移酶KDM5A(JARID1A)、KDM5C(JARID1C)和KDM6A(UTX)在实体以及血液系统肿瘤中均出现了大规模重复性突变，因此LSD1/KDM1A也一度成为临床治疗AML的研究热点[17]。LSD1在AML(急性髓系白血病)中高表达，多种LSD1抑制剂在临床应用中展现出对AML一定的治疗作用[18]，在MLL-AF9+AML细胞中，敲低LSD1的表达水平，H3K4me2/H3K4me3比例升高从而降低了白血病发展风险[19～21]。但是关于LSD1在白血病细胞分化、增殖以及凋亡的研究比较少。

图2 LSD1基因敲除对K562细胞凋亡水平的影响Fig.2 The effect of LSD1 knockout on apoptosis level of K562 cells.

K562细胞是研究白血病发病机理的重要模型，我们在前期的实验中，已经使用人慢性髓系白血病K562细胞，利用 CRISPR/Cas9技术对K562细胞的LSD1 Exon1进行定点切割，并获得了LSD1+/-、LSD1-/-K562细胞株，通过对敲除株的研究发现，LSD1+/-、LSD1-/-K562细胞株的红系特异性表面标记CD235a的表达被显著抑制，并且与LSD1的表达呈剂量依赖关系。因此我们推测，LSD1可能参与调控了K562细胞红系分化过程中的红细胞成熟进程。同时我们发现LSD1+/-、LSD1-/-K562细胞株的增殖能力明显下降，这暗示了LSD1基因的抑制能够有助于白血病的治疗，因此本实验利用细胞凋亡检测，验证了敲除LSD1基因后，K562细胞凋亡水平并未受到影响。同时，数据显示野生型K562细胞凋亡很不明显，因此有必要进一步研究在饥饿或诱导剂处理下，LSD1对K562细胞凋亡是否有影响。另外，敲除LSD1基因后，野生型和敲除株细胞的K562细胞被阻滞在细胞周期的G0/G1期，进入DNA复制期的细胞变少，细胞增殖明显减慢；结果中细胞周期改变与LSD1敲除比例未出现明显的计量依赖性，因此认为，除了影响细胞周期外，可能还存在其他的信号通路，受到LSD1敲除的影响从而减慢了细胞的增殖。

综上所述，LSD1基因K562细胞在红系分化进程中至关重要，并且起到维持细胞凋亡平衡状态以及细胞顺利增殖的作用。因此，抑制LSD1的活性，理论上可以成为治疗白血病的策略手段。同时，本研究也为临床上LSD1抑制剂治疗白血病提供了有效的理论依据。

参 考 文 献

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