膈下逐瘀汤降低基质金属蛋白酶组织抑制因子的表达抑制大鼠肝纤维化形成

张鹏 苗玉荣 曾锦荣 吴正平

1宜春学院医学院（江西宜春336000）；2暨南大学第一附属医院（广州510630）

肝纤维化是肝细胞经炎症刺激以及发生坏死时，肝脏中胶原蛋白等细胞外基质的增生与降解失去平衡，进而导致肝脏内纤维结缔组织发生异常沉积的病理过程，是慢性肝病的病理基础，具有可逆性［1］。肝纤维化的发生、发展过程与细胞外基质（extracellular matrix，ECM）有关，对ECM起主要调节作用的有基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）、金属蛋白酶组织抑制因子（tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMP）［2］，TIMPs主要功能是拮抗MMPs，使ECM保持平衡。因此寻找能够有效减少TIMP-1表达，从而降解肝纤维化基质，进而抑制甚至逆转肝纤维化的药物，并在肝纤维化阶段进行早期药物干预治疗，具有重要的临床意义。现代祖国医学认为：活血化瘀，注重病证结合，可有效抑制甚至逆转肝纤维化的发生发展［3］。本研究拟通过检测经膈下逐瘀汤治疗后肝纤维化SD大鼠的肝功能指标、肝纤维化的变化及基质金属蛋白酶抑制因子（TIMP-1）表达情况，探索膈下逐瘀汤在肝纤维化治疗中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 动物：SD大鼠110只，雌雄各半，清洁级，体重（200±20）g，购自长沙天勤生物技术有限公司，许可证编号：SCXK（湘）2014-0015。药品：膈下逐瘀汤：当归、桃仁（研泥）、红花、甘草、川芎、丹皮、赤芍、乌药、灵脂（炒）、香附、枳壳、玄胡索按9：9：9：9：6：6：6：6：6：4.5：4.5：3的比例，水煎制，煎剂于恒温水浴锅中浓缩，直至含生药1.0g/L的汤剂作为原药，备用。

1.2 试剂和仪器 丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、白蛋白（ALB）、总蛋白（TP）及总胆红素（T-bil）试剂盒购于南京建成生物工程研究所；基质金属蛋白酶组织抑制因子（TIMP-1）抗体、SP-即用型免疫组化试剂盒、DAB显色剂和SABC免疫组化染色试剂盒及DAB显色试剂盒均为福州迈新生物技术开发有限公司产品；苏木素为Sigma公司产品；水溶性伊红为Sigma公司产品；主要仪器BS250S型精密天平（北京赛多利斯天平有限公司）；750型自动生化分析仪（日立公司）。

1.3 肝纤维化模型建立 除正常组外，其余各组大鼠皮下注射纯CCl4，剂量5 mL/kg。之后皮下注射含20%CCl4的花生油，剂量3 mL/kg，2次/周，连续12周。

1.4 实验分组及处理 第一次110只SD大鼠适应饲养1周后，随机分为两组，第一组（正常对照组，记为A组）：20只大鼠，不作其他处理，常规饲养12周；第二组（造模组）：90只大鼠，腹腔注射CC140.025 mL（用花生油 1∶6稀释），每周 2次，共8周，8周末从中随机抽取6只大鼠，处死并取得肝组织标本，以观察肝纤维化造模效果。第二次：剩余84只造模组大鼠随机分成3组：模型组（B组）、膈下逐瘀汤低剂量组（C组）、膈下逐瘀汤高剂量组（D组），各28只。各组继续腹腔注射CC140.025 mL（用花生油 1∶6稀释），每周2次，共4周。C组与D组分别予以膈下逐瘀汤高剂量（原药直接使用，生药含量为1 g/L）和膈下逐瘀汤低剂量（原药稀释1倍，生药含量为0.5 g/L），按1 mL/100 g体质量灌胃，1次/d，共4周，而A组和B组给予等容量蒸馏水。动物实验结束后，采用摘眼球采血法最大量取血，并置于未加抗凝剂的普通干净玻璃试管中。剖开大鼠腹腔暴露肝脏，留取肝脏左叶，留取部分肝组织于4%中性福尔马林液固定，置于包埋盒中，于切片机切片，厚度3 μm，裱片于普通载玻片上进行免疫组化染色。

1.5 血清肝功能指标检测 大鼠末次给药后禁食24 h，3%戊巴比妥麻醉大鼠，自大鼠腹主动脉取血5～8 mL，离心（3 000 r/min，15 min），取血清放入冰箱（-20℃）保存。按试剂盒说明书中方法操作，检测ALT、AST、ALB、TP及T-bil五项肝功能生化指标。

1.6 肝纤维化评分 各组大鼠肝组织行常规HE染色，根据《肝纤维化分期半定量评估系统Ishak》进行评分［4］。选取10个高倍视野进行观察，并评定。评分方法：0分：完全无纤维化；1分：汇管区周围部分细胞坏死，纤维隔可见，呈轻度纤维化；2分：30%汇管区出现纤维化，且形成纤维隔；3分：70%汇管区出现纤维化，偶见汇管区桥接纤维化；4分：90%汇管区呈纤维化，伴汇管-汇管桥接纤维化及汇管-中央桥接纤维化。

1.7 肝脏组织TIMP-1检测 采用SP法检测TIMP-1在大鼠肝组织中的阳性表达：TIMP-1抗体稀释度为1∶200；参照免疫组化显色标准进行结果判断：根据染色范围及程度评定免疫组化结果。

1.8 统计学方法 实验结果以均数±标准差（±s）表示，采用SPSS 14.0软件，多组数据间的比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对血清肝功能的影响

2.1.1 实验大致情况 在实验进程中，110只SD大鼠中有7只死亡（非人为处死），分别为模型组4只、膈下逐瘀汤低剂量组2只和膈下逐瘀汤高剂量组1只，死亡率为6.4%。

2.1.2 血清肝功能指标比较 正常组大鼠血清ALT含量为（29.15±3.64）U/L，低剂量组血清ALT（56.84±7.12）U/L与高剂量组大鼠血清ALT（49.25±5.47）U/L较模型组血清 ALT（64.27±8.57）U/L组降低，差异具有统计学意义（P＜0.01）；正常组、低剂量组与高剂量组大鼠血清AST、T-Bil较模型组降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）；模型组大鼠血清中TP、ALB分别为（63.42± 7.58）g/L、（34.29± 4.26）g/L，正常组、低剂量组与高剂量较模型组升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；见表1。

2.2 肝维化Ishak评分 在Ishak评分为0分方面，与正常组大鼠比例为100%相比，其余各组所占比例为0，差异具有统计学意义（P＜0.01）；在Ishak评分为1分方面，与模型组大鼠比例为12.5%相比，低、高剂量组所占比例明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.01）；在Ishak评分为2分方面，与模型组大鼠比例为12.5%相比，低、高剂量组所占比例明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；在Ishak评分为3分方面，与模型组大鼠比例为33.3%相比，低、高剂量组所占比例降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）；在Ishak评分为4分方面，与模型组比例为41.7%相比，低、高剂量组所占比例明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.01）。见表2。

2.3 各组大鼠肝脏组织病理特点 肉眼观察大鼠肝脏大体标本，正常组：表面淡红色，切面实性，淡红色；模型组：肝脏表面灰白色，切面呈明显结节状，结节间可见灰白色纤维样物；低剂量组：膈下逐瘀汤肝脏表面均为淡红色，切面呈不明显的结节状，淡红色；高剂量组：与低剂量组相似，肉眼无明显差异。见图1。

表1 各组肝纤维化大鼠血清肝功能指标水平Tab.1 Each group of liver fibrosis rat serum liver function index level ±s

表1 各组肝纤维化大鼠血清肝功能指标水平Tab.1 Each group of liver fibrosis rat serum liver function index level ±s

注：与模型组比较，#P＜0.01，*P＜0.05

组别正常组模型组低剂量组高剂量组n 20 24 26 27--3.0 6.0 ALT（U/L）29.15±3.64#64.27±8.57 56.84±7.12#49.25±5.47#AST（U/L）43.81±4.59*78.65±9.72 71.35±9.06*66.27±8.15*T-bil（μmol/L）16.27±2.15*20.25±2.68 18.59±2.45*17.62±2.38*TP（g/L）74.26±8.92*63.42±7.58 67.52±7.83*70.15±8.36*ALB（g/L）41.38±5.29*34.29±4.26 36.51±4.72*39.28±5.04*

表2 各组肝纤维化大鼠Ishak评分Tab.2 Ishak scores of liver fibrosis rats in each group例

图1 各组大鼠肝脏纤维化情况及TIMP-1表达情况Fig.1 Hepatic fibrosis and expression of TIMP-1 in rats in each group

HE染色正常组：肝小叶结构正常，汇管区周围可见少量胶原纤维增生。模型组：肝小叶内大量纤维组织增生，可见大量汇管-汇管桥接纤维化和汇管-中央桥接纤维化区，呈相互交结状，形成不完全或完全性假小叶，肝细胞索排列紊乱，肝血窦扩张，胞浆疏松化，纤维间隔可见大量淋巴、单核细胞浸润。与模型组比较，膈下逐瘀汤组肝小叶结构修复现象明显，Kupffer细胞明显增生，有较多胶原纤维生成，但未形成完全假小叶，变性肝细胞和炎性细胞浸润显著减轻，纤维化增生程度减轻，而高剂量组纤维化增生程度明显减轻。见图1。

2.4 对肝脏组织TIMP-1表达的影响 免疫组织化学结果显示：正常组大鼠肝组织中TIMP-1几无表达；模型组阳性染色范围广，汇管区、纤维间隔内和肝窦处的间质细胞胞浆均可见到，膈下逐瘀汤低剂量组阳性染色程度较模型组减轻，高剂量组染色程度明显减轻见图1。

3 讨论

肝纤维化是一种常见的严重威胁人类生命健康的疾病，是机体对慢性肝损伤炎症刺激的一种修复反应，也是肝硬化发生发展的病理基础。目前治疗肝硬化真正有效的西药很少，因此寻找能干预肝纤维化、改善肝病进展的中药，可成为新的研究方向。清代医家王清任认为膈下逐瘀汤可通过活血行气，从而达到逐瘀的目的［3］。从现代研究来看，逐瘀也可改善肝脏血液循环，促进肝细胞再生，缩小肿大的脾脏，对防治肝纤维化有一定作用［5］。

肝纤维化形成涉及复杂的细胞、分子机制，其本质是肝脏内细胞外基质（ECM）的大量沉积，而ECM的代谢主要受MMPs及其抑制因子TIMPs调节［6］。TIMPs主要功能是与MMPs相互拮抗作用，使ECM处于稳态，是重要的酶家族之一，目前已发现4种，即TIMP-1到TIMP-4。TIMP-1在正常肝组织中表达很少，而在纤维化过程中，由于被激活的肝脏星状细胞（HSC）大量分泌TIMP-1，使其含量进行性升高，而后与MMP-1特异性结合，抑制MMP-1活性，降低ECM的降解，使ECM在肝组织间隙沉积，促进肝脏纤维化进程［7］。

在肝纤维化中，ECM合成增多和降解减少的全过程，MMPs减少，而TIMPs则增加［8］。研究表明中药绞股蓝总皂苷［9］对CCl4诱导肝纤维化大鼠TIMP-1及MMP-1起着积极影响。用绞股蓝总皂苷治疗肝纤维化的小鼠动物模型中小鼠体内TIMP-1的表达下降而MMP-1逐渐增加，从而减轻肝纤维化程度。复方丹参滴丸［10］、肝复康［11］、银杏叶提取物［12］等中医药也有类似的作用。因此对肝组织纤维化的治疗也将成为祖国中医药的应用热点之一。

本研究通过检测经膈下逐瘀汤治疗后的各组肝纤维化大鼠肝功能指标（ALT、AST、ALB、TP及T-bil）、肝纤维化Ishak评分及TIMP-1表达的变化，结果显示：正常组、低剂量组及高剂量组血清ALT、AST、T-Bil含量较模型组降低，其中高剂量组的血清ALT、AST、T-Bil含量最低，而低剂量组次之，差异有统计学意义（P＜0.01，见表1），这说明经膈下逐瘀汤治疗的大鼠，其肝功能损伤程度减轻；正常组、低剂量组与高剂量组血清TP、ALB较模型组升高，其中高剂量组血清TP、ALB含量最高，而低剂量组次之，差异具有统计学意义（P＜0.05，表1），这说明经膈下逐瘀汤治疗的大鼠，其肝功能合成能力增强，有助于肝脏的修复。在Ishak评分为0分方面，正常组大鼠比例为100%，其余各组所占比例为0，差异具有统计学意义（P＜0.01），提示造模成功；在Ishak评分为1分、2分方面，与模型组大鼠相比，低、高剂量组所占比例明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；在Ishak评分为3分、4分方面，与模型组大鼠相比，低、高剂量组所占比例明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05），经膈下逐瘀汤治疗的大鼠，肝纤维程度明显减轻。从肝纤维化大鼠肝功能指标、肝纤维化Ishak评分方面，可知膈下逐瘀汤可以改善肝功能、增强肝脏的修复功能及降低肝纤维化程度。从肝脏组织TIMP-1表达上看，正常组大鼠肝组织中TIMP-1几无表达，模型组TIMP-1明显表达，膈下逐瘀汤低剂量组及高剂量组阳性染色程度较模型组减轻（图1）。这提示肝纤维化与TIMP-1上调有关，与文献报道一致［7］。肝纤维化是各种病因引起慢性肝实质损伤后的瘢痕修复反应［13］，黄大健等［14］研究发现大剂量荔枝核总黄酮可减轻胆汁淤积性肝纤维化大鼠肝损伤及有效改善肝纤维化程度，其作用机制是通过抑制生长因子-β1（TGF-β1）和骨桥蛋白（osteopontin，OPN）高表达，减少细胞外基质（ECM）的分泌，从而缓解肝脏的纤维化。而本研究发现膈下逐瘀汤可能通过抑制TIMP-1分泌，减少ECM的分泌，从而抑制肝脏纤维化。膈下逐瘀汤抑制TIMP-1分泌，与通过阻止TGF-β/Smad信号通路［14-15］的启动作用机制不同，而这两种机制最终都可以达到减少ECM的分泌，从而抑制肝脏纤维化，这证明肝纤维化的过程受多种细胞因子的调控，其机制还需要进一步研究。

综上所述，本文以SD肝纤维化大鼠为研究对象，结果显示膈下逐瘀汤具有抑制TIMP-1表达，从而起到抗肝纤维化作用，初步探索了膈下逐瘀汤对肝纤维化的保护作用及其分子机制。实验表明膈下逐瘀汤在预防和治疗肝纤维化中具有积极作用，同时也为膈下逐瘀汤成为治疗肝纤维化新方法提供理论基础，为我们在临床上寻找到更安全、廉价、高效的治疗肝纤维化中医药物提供了依据。

参考文献

［1］DELEVE L D.Liver sinusoidal endothelial cells in hepatic fibrosis［J］.Hepatology，2015，61（5）：1740-1746.

［2］HENDERSON N C，IREDALE J P.Liver fibrosis：cellular mechanisms of progression and resolution.［J］.Clin Sci，2007，112（5）：265-280.

［3］陈兰羽，马继征，张云，等.膈下逐瘀汤治疗慢性肝病实验研究进展［J］.中西医结合肝病杂志，2014，24（2）：123-126.

［4］EVERHART J E，WRIGHT E C，GOODMAN Z D，et al.Prognostic value of Ishak fibrosis stage：Findings from the hepatitis C antiviral long-term treatment against cirrhosis trial［J］.Hepatology，2010，51（2）：585.

［5］乌兰图娅：膈下逐瘀汤对肝瘀血疗效的分析［J］.中国现代药物应用，2015（19）：258-259.

［6］MURPHY F R，ISSA R，ZhOU X，et al.Inhibition of apoptosis of activated hepatic stellate cells by tissue inhibitor of metalloproteinase-1 is mediated via effects on matrix metalloproteinase inhibition：implications for reversibility of liver fibrosis［J］.J Biol Chem，2002，277（13）：11069.

［7］WEERACHAYAPHORN J，LUO Y，MENNONE A，et al.Deleterious effect of oltipraz on extrahepatic cholestasis in bile ductligated mice［J］.J Hepatol，2014，60（1）：160-166.

［8］HAN Y P.Matrix metalloproteinases，the pros and cons，in liver fibrosis［J］.J Gastroenterol Hepatol，2006，21（Supplement s3）：S88-S91.

［9］景华，李雪梅，冯琴，等.绞股蓝总皂苷对四氯化碳诱导的肝纤维化大鼠肝组织基质金属蛋白酶及其抑制物的影响［J］.中西医结合肝病杂志，2012，22（6）：352-354.

［10］柳占彪，许放，张少卓，等.复方丹参滴丸对大鼠肝纤维化治疗作用的组织病理学影响［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18（8）：246-248.

［11］LOU J L，JIANG M N，LI C，et al.Herb medicine Gan-fu-kang attenuates liver injury in a rat fibrotic model［J］.J Ethnopharmacol，2010，128（1）：131.

［12］ZHANG C，ZU J，SHI H，et al.The effect of Ginkgo biloba extract（EGb 761）on hepatic sinusoidal endothelial cells and hepatic microcirculation in CCl4 rats［J］.Am J Chin Med，2004，32（1）：21.

［13］彭令荣，孟占鳌，王劲，等.磁共振弹力成像与扩散加权成像诊断慢性乙型病毒性肝炎纤维化程度分级的对比［J］.实用医学杂志，2017，33（17）：2930-2933.

［14］黄大健，赵永忠，卢青，等.转化生长因子-β1和骨桥蛋白在肝纤维化大鼠肝组织的表达及荔枝核总黄酮的干预［J］.实用医学杂志，2013，29（22）：3646-3649.

［15］黄越龙，周春光，陈燕.TGF/Smad信号通路与肝纤维化的研究进展［J］.实用医学杂志，2011，27（10）：1883-1884.