TLR4信号通路介导DIO 小鼠脂肪局部RAS激活机制

王梅 麦旭东 邓兴锋 孙嘉 陈宏

南方医科大学珠江医院1呼吸内科，2内分泌科，3消化内科（广州 510280）

慢性炎症是肥胖导致动脉硬化、糖尿病、脂肪肝等疾病的主要因素，脂肪细胞是肥胖致炎作用的主要途径［1］。肾脏、心脏、脂肪组织等许多组织部位存在肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system，RAS）成分，包括肾素、血管紧张素原（angiotensinogen，AGT）、血管紧张素转换酶（angiotensin converting enzyme，ACE）和血管紧张素Ⅰ（angiotensinⅠ，AngⅠ）、血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）［2-3］。脂肪组织存在局部RAS系统，参与局部组织的炎症反应，但活体肥胖状态下激活脂肪组织局部RAS系统的确切机制尚未明确。

Toll样受体4（Toll like receptor4，TLR4）是Toll样受体（Toll like receptor，TLRs）家族中的一员，是一种病原相关模块识别受体。TLR4可以与配体结合后激活丝裂原活化蛋白激酶和核因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）介导炎症反应相关通路［4-6］。在细胞水平研究中有证据表明肝细胞中存在TLR4和血管紧张素Ⅱ相互作用，并参与肝脏炎症的发生［7］，而心肌细胞中激活TLR4信号通路可激活RAS［8］。脂肪细胞RAS系统研究中，细胞水平研究证实3T3-L1脂肪细胞存在TLR4通路并且能被脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）所激活［9-10］。本研究选取6周龄雄性C57BL/6小鼠高脂饮食喂养14周构建DIO小鼠动物模型，予TLR4阻断剂 TAK-242（Resatorvid），非诺贝特（fenofibrate）分别治疗DIO小鼠，检测小鼠皮下脂肪的RAS成份、TLR4受体表达情况，在动物水平探讨TLR4信号通路与脂肪组织局部RAS激活的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 6周龄雄性C57BL/6小鼠33只，购自南方医科大学动物实验中心（合格证编号为：NO.44002100005087），体重（17.2 ± 0.3）g，饲养条件：在恒定的温度（24℃）和12 h光/暗周期的SPF（specific pathogen free）动物级实验室（南方医科大学，广州）。

1.1.2 试剂和仪器 高脂饲料（MD12033）购于江苏美迪森生物医药有限公司；普通饲料购于南方医科大学动物实验中心；非诺贝特（fenofibrate）购于法国利博福尼制药公司；TAK-242（Resatorvid）购于上海皓元生物医药科技有限公司）；试剂盒：RNAiso Reagent（TaKaRa，Janpan），ELISA Kit（TaKaRa，Janpan）；引物购于上海生工生物工程有限公司；磷酸盐缓冲液（PBS），油红O染料购于美国sigma公司；全自动生化分析仪（深圳市库贝尔生物科技有限公司）。其余试剂为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 建立饮食诱导肥胖小鼠模型及药物治疗6周龄雄性C57BL/6小鼠适应性喂养正常饲料1周后，分为正常饮食组（normal diet，ND，n=5）和高脂饮食组（high-fat diet，HFD，n=28），喂养14周，每周称重。正常饮食包含20%kcal来源于脂肪，60%kcal来源于蛋白质，20%kcal来源于碳水化合物。高脂饮食主要包含60%kcal来源于脂肪，20%kcal来源于蛋白质，20%kcal来源于碳水化合物。21周龄时选定体重超过正常饮食组平均体重20%的小鼠为肥胖小鼠。将符合要求的小鼠重新随机分为肥胖空白组（obesity，OB，n=5），非诺贝特治疗组（fenofibrate，FF，n=5）、TAK-242治疗组（TAK-242，TAK，n=5）。FF组予100 mg/（kg·d）治疗2周，TAK组腹腔注射TAK242，3 mg/（kg·d）治疗2周。

1.2.2 生化指标测定 23周龄各组小鼠颈椎脱臼处死前禁食12 h，心脏取血，离心留取血清后，-20℃冰箱保存。采用全自动生化分析仪检测各标本的三酰甘油（triglyceride，TG），游离脂肪酸（nonesterified fatty acid，NEFA），丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT），天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）。

1.2.3 ELISA法检测游离脂肪酸 小鼠处死后小心切除皮下白色脂肪和肝脏，称重。取等质量肝脏组织后，按照小鼠游离脂肪酸ELISA Kit说明书的步骤用检测标本游离脂肪酸含量。

1.2.4 油红O染色观察皮下脂肪、肝脏组织切片 油红O染色法分别对脂肪组织、肝脏组织染色，并用PBS洗涤3次。再用4%的甲醛溶液固定。PBS再洗涤2次后，取适量新制的改良油红O染色剂染色30 min，显微镜下开始作动态观察。若镜下观察到脂肪滴颜色逐渐加深，呈鲜红的、大小不一的串珠样时，即可吸尽油红O染液终止染色，并用磷酸盐缓冲液小心漂洗后，加入苏木素液淡染胞核，再次予PBS漂洗，在镜下显微成像观察。

1.2.5 RT-PCR （1）细胞总RNA的抽提：按照TaKaRa公司RNAiso Reagent说明书提取总RNA，分装后置-80℃冰箱保存待用；（2）检测RNA完整性：取1.5 μL RNA样品，drop one紫外分光光度仪检测260 nm和280 nm处的OD值，OD260/280比值在1.8～2.0之间，说明RNA纯度较高；（3）逆转录反应：将1 μg模板RNA、250 μmol/L随机引物加入反应体系，按照说明书操作，将总RNA逆转录为cDNA，置-20℃冰箱保存待用；（4）RT-PCR反应设计引物：血管紧张素原基因引物上游5′-CTGCTCCAGGCTTTCGTCTA-3′，下游：5′AACTGGGTCAGTGGATAAATCC-3′；血管紧张素Ⅱ1型受体（angiotensinⅡtype 1 receptor，AT1R）基因引物：上游5′-CGGTATCCGAATCTGAATGT-3′，下游5′-GCCCCAATCCTACTGTTAGT-3′；TLR4基因引物：上游5′-ACCTGGAATGGGAGGACAAT-3′，下游 5′-GTCCAAGTTGCCGTTTCTTG-3′；GAPDH 为内参基因引物：上游：5′-GGCCTCCAAGGAGTAAGAAA-3′，下游：5′-GCCCCTCCTGTTATTATGG-3′；以逆转录反应所得cDNA为模板，用上、下游引物PCR扩增目的片段。参照说明书建立Real-time PCR反应体系，反应条件：95℃ 10 min；95℃10 s、60℃20 s，72℃ 15 s，40个循环；95℃ 15 s，55℃45 s，95℃15 s。据溶解曲线判断引物特异性，单峰说明引物特异性佳，多峰说明引物特异性差，需重新设计引物；（5）据ΔΔCT法计算基因的相对表达量。

1.2.6 统计学处理 采用IBM SPSS Statistics 22统计软件进行统计学分析，所有定量结果用均数±标准差表示。数据先进行正态检验及方差齐性检验，符合则多组间比较采用单因素方差分析的LSD法进行多重比较；不符合则多组间比较采用非参数检验的Kruskal-WallisH方法，若检验结果显著（P＜0.05），再进行多组间两两比较。P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠各项生理基础指标比较 OB组、FF组、TAK组各组小鼠体重、皮下脂肪重量与正常饮食组比较，有明显差异。OB组TG、血清NEFA含量较正常饮食组明显升高。予非诺贝特治疗后，FF组小鼠肝内NEFA及ALT、AST含量较OB组高，且小鼠肝脏重量显著增加，皮下脂肪质量和TG含量均较OB组明显降低，而血清NEFA含量并没有明显变化。予TAK-242治疗后，TAK组肝内NEFA含量降低，余数据无明显改变。见表1，图1。

表1 各组小鼠各项生理及代谢指标比较Tab.1 Physiological and metabolic changes of the groups ±s

表1 各组小鼠各项生理及代谢指标比较Tab.1 Physiological and metabolic changes of the groups ±s

注：OB组、TAK组、FF组与正常饮食组比较，*P＜0.05，△P＜0.001；TAK组、FF组与OB组比较，▲P＜0.05，☆P＜0.001

体重（g）肝脏重量（g）皮下脂肪重量（g）血清TG（mmol/L）血清NEFA（mmol/L）肝内NEFA（nmol/g）ALT（U/L）AST（U/L）正常饮食组27.5±0.5 1.3±0.17 0.08±0.01 0.86±0.04 0.32±0.01 1 126.4±98.4 29.20±5.81 68.90±10.98肥胖空白组（OB）33.9±1.5△1.1±0.07 2.4±0.61△1.51±0.27*0.82±0.07△1 607.7±30.4*35.19±8.69 70.50±11.11 P值0.000 0.151 0.000 0.034 0.000 0.001 0.139 0.892 TAK-242治疗组（TAK）30.9±0.7△1.1±0.11 1.88±1.12 1.21±0.35 0.76±0.05 1 073.9±75.3☆32.23±9.32 66.90±15.29 P值0.000 0.147 0.228 0.686 0.101 0.000 0.492 0.563非诺贝特治疗组（FF组）29.7±0.5*2.5±0.31☆1.01±0.52▲0.781±0.16▲0.88±0.06 2 402.8±259.4▲60.14±7.89▲95.56±13.12▲P值0.003 0.000 0.005 0.011 0.152 0.013 0.001 0.008

图1 血清及肝脏组织中游离脂肪酸含量Fig.1 Concentration of NEFA in liver and serum

2.2 脂肪组织和肝脏组织RAS成分表达变化脂肪组织中，OB组小鼠AT1R、AGT表达量均显著高于正常饮食组，给予TAK-242药物治疗后，TAK组小鼠AT1R，AGT表达量均明显低于OB组；给予非诺贝特治疗后的FF组小鼠AT1R、AGT表达量较OB组均无明显改变。在肝脏组织中，OB组小鼠AT1R、AGT表达量对比正常饮食组升高不明显，但予TAK-242药物治疗后，能明显下调AT1R表达量；予非诺贝特组治疗后，FF组小鼠AT1R、AGT，TLR4表达量对比正常饮食组均明显升高。见图2。

2.3 脂肪组织和肝脏组织TLR4受体表达变化脂肪组织中，OB组小鼠TLR4表达量显著高于正常饮食组，予TAK-242药物治疗后，TAK组小鼠TLR4表达量显著低于OB组；给予非诺贝特治疗后的FF组小鼠TLR4表达量较OB组有下降趋势。在肝组织中，OB组小鼠TLR4表达量同样高于正常饮食组，TAK组小鼠TLR4表达量没有明显改变；而非诺贝特干预后的FF组小鼠TLR4表达量较OB组高。见图3。

2.4 脂肪组织和肝脏组织油红O染色 图4A示200×高倍视野下正常饮食组小鼠肝脏切片未见肝脏脂肪沉积，OB组小鼠肝脏可见有沉积的脂肪小滴，TAK-242组小鼠肝脏脂肪小滴略少，FF组小鼠肝脏沉积的脂肪小滴比OB组大。图4B示200×高倍视野下正常饮食组小鼠脂肪组织脂肪细胞较小，OB组与TAK组小鼠脂肪细胞明显增大，而FF组小鼠脂肪组织中脂肪细胞与OB组相比堆积较少。见图4。

图2 脂肪组织和肝脏组织RAS成分表达变化Fig.2 Expression of local rennin-angiotensin system in adipose and liver tissues

图3 脂肪组织和肝脏组织TLR4受体表达变化Fig.3 Expression of local rennin-angiotensin system in adipose and liver tissues

3 讨论

肾素-血管紧张素系统是人体内重要的体液调节系统。在心脏、血管壁、脂肪等局部组织或细胞表达的RAS称为局部RAS，RAS主要的效应分子为AngⅡ，其由AGT经过肾素、血管紧张素转换酶等催化生成，并通过旁分泌或自分泌主要结合AT1R发挥作用，并且与系统RAS相互影响，与多种疾病密切相关［5］。TLR4是一种病原相关模块识别受体，介导激活NF-κB 炎症反应相关通路［4-6］。前期研究发现脂肪细胞具有完整的RAS成分，TLR4受体激动剂LPS能够激活3T3-L1脂肪细胞的TLR4信号通路，通路激活后能够刺激脂肪细胞RAS成分表达增加分泌更多AGT和AngⅡ，预先予AT1R受体阻滞剂厄贝沙坦预处理，能阻断RAS的作用，提示LPS所致的TLR4-NF-κB的激活包含激活RAS后AngⅡ/AT1R的致炎作用［10］。活体小鼠中NEFA与胎球蛋白A（Fetuin-A，Fet-A）结合体（NEFA/Fetuin-A）是激活TLR4信号通路的关键［11］。前期研究还发现3T3-L1脂肪细胞在Fet-A存在的前提下，NEFA中的棕榈酸（palmitic acid，PA）能够上调表达AngⅡ、AGT、AT1R，并且该作用能被TLR4阻断剂TAK-242和NF-κB阻断剂BAY117082所抑制，证实NEFA/TLR4-NF-κB信号通路是脂肪组织局部RAS激活的重要信号通路［12］。

我们研究发现，C57BL/6小鼠喂养高脂饲料14周后，小鼠整体表现出DIO的特点：体重明显增加，高甘油三脂血症，高游离脂肪酸血症，皮下脂肪大量堆积，肝脏脂肪含量增加。在肥胖的状态下，未经药物治疗的小鼠脂肪组织的AGT、AT1R、TLR4 mRNA均明显高于正常饮食对照组，RAS成分AGT、AT1R和TLR4受体表达量升高，说明肥胖可导致RAS系统成分高表达［13］，活体小鼠脂肪组织存在局部肾素-血管紧张素系统，并可在肥胖状态下被激活。

肥胖小鼠脂肪中RAS成分及TLR4受体表达量确有升高，激活TLR4信号通路可能从配体及受体两方面同时影响脂肪组织RAS，但两者相互作用如何，需要进一步证实。TLR4受体抑制剂TAK-242是一种TLR4信号通路小分子抑制剂，通过cys747结合TLR4胞内段TIR结构域而发挥作用［14-15］。予TAK组小鼠腹腔注射TAK-242 3 mg/（kg·d）持续治疗2周后，AGT、AT1R、TLR4表达量均明显降低。说明TLR4阻断剂可能一方面直接阻断TLR4配体受体结合作用，阻断TLR4通路，另一方面可能通过抑制TLR4受体表达量，从而下调RAS成分的表达。我们首次在动物实验上发现阻断TLR4配体受体结合作用是下调脂肪组织局部RAS成分表达的关键。

图4 脂肪组织和肝脏组织油红O染色（×200）Fig.4 Oil-Red-O staining of liver and adipose tissues

研究表明过氧化物酶增殖体激活受体α（PPARα）基因能负向调节TLR4受体表达［16］。激活PPARα，调节血脂TG、NEFA可能影响TLR4信号通路，从而影响RAS成分的表达。非诺贝特是氯贝丁酸衍生物类血脂调节药，通过激活PPARα，激活脂解酶和减少载脂蛋白CIII合成，使血浆中脂肪降解和三酰甘油清除明显增加。我们发现FF组小鼠TG明显降低，而血清中NEFA并没有明显下降，这可能与药物增加脂肪组织中脂质氧化酶相关基因的表达相关［17］。在脂肪组织中，TLR4受体表达量有下降趋势，然而RAS成分AGT、AT1R并没有明显改变，说明在脂肪组织中通过激活PPARα从而抑制TLR4受体表达量对RAS成分表达作用并不明显。

皮下脂肪和内脏脂肪组织具有不同的分子、细胞和解剖特征［18］，同时肝脏是体内脂肪代谢重要枢纽。有研究表明TLR4-RAS参与肝脏炎症的发生［5］，且在高脂饮食诱导的非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）模型小鼠发现肝脏中TLRs受体通过NF-κB通路，上调TNF-α等炎症因子［19］。因此我们还观察小鼠药物治疗后肝脏组织中局部RAS成分变化。小鼠肝脏组织RAS成分及TLR4受体均有所升高，予TLR4阻断剂治疗后，除AT1R表达量下调外，AGT、TLR4无明显改变。此外，非诺贝特干预后肝内NEFA的含量增加，AGT、AT1R、TLR4表达量亦增加。说明肝组织内RAS成分激活途径与皮下脂肪组织激活途径可能不同，非诺贝特可能通过增加NEFA与Fet-A结合体该配体的含量，影响肝脏组织中局部RAS成分表达，但具体机制仍需进一步探究。

本研究首次利用TLR4抑制剂（TAK-242，Resatorvid）在动物水平探讨局部RAS成分激活与TLR4/NF-κB信号通路的关系，为脂肪组织局部RAS与相关疾病关系的动物水平研究提供依据。但是本研究局限于单一的Toll样受体及信号通路，未从多方面多通路探讨TLRs与脂肪组织局部RAS激活的作用机制。本课题拟下一步实验中，进一步探讨RAS成分激活与TLR4/NF-κB信号通路下游分子的关系，以及探讨不同TLRs对不同组织局部RAS成分激活的影响。

综上所述，DIO状态下可通过TLR4信号通路介导激活脂肪组织RAS系统，TAK-242特异性的阻断TLR4信号通路，能下调RAS成分表达，提示抑制TLR4配体受体结合作用是阻断脂肪组织局部RAS激活的重要途径。TLR4/NF-κB信号通路可作为揭示肥胖患者慢性炎症发病机制研究的切入点，为将来对肥胖慢性炎症研究提供依据。

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