中药催情散的急性和亚慢性毒性研究

刘 伟，程 波，蒋瑞东，任书男,祁生旺，李云章，查斯图

(1内蒙古农业大学 兽医学院，内蒙古 呼和浩特 010018;2 巴林左旗动物卫生监督所,内蒙古 赤峰 025450)

不孕症作为奶牛场的四大疾病之一，是影响奶牛繁殖和养殖业经济效益的主要因素，其中卵巢疾病是导致奶牛不孕的主要原因，而奶牛持久黄体是最常见的卵巢疾病[1-2]。持久性黄体可持续分泌孕酮，抑制卵泡发育，从而使发情周期停止循环而出现乏情现象，导致奶牛空怀时间及产犊间隔延长[3]，最终降低奶牛场经济效益。临床上往往使用外源激素对卵巢疾病进行治疗，由于激素的长期及不当使用，容易造成奶牛性周期紊乱和激素在牛奶中的残留，进而危害人类健康。

由于中药具有副作用小、药物残留量少的特点逐渐受到人们的青睐[4]。闫宝琪等[4]用一定剂量的藿芪灌注液治疗奶牛持久黄体取得不错的疗效；梁光华等[5]用中药促孕散治疗奶牛持久黄体，发情有效率较高，并且治疗后奶牛血清中生殖激素、微量元素及白介素也有相应的变化。

中药方剂催情散由“内蒙古奶牛不孕症的病因调查及中西医综合治疗集成”课题组相关人员根据中兽医理论研制而成，由淫羊藿、阳起石、菟丝子、当归、川芎、熟地等12味中药组成，具有温肾补肾、壮阳固精、活血祛瘀、行气解郁的作用[6]。本试验以小鼠和大鼠为试验动物，研究了催情散的急性毒性和亚慢性毒性，以期对该方剂的安全性进行科学评价，并为其临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 试验药物 中药催情散由淫羊藿、阳起石、菟丝子、当归、川芎、肉苁蓉、熟地、陈皮、木香、厚朴、香附、甘草等12味中药组成，中药材购自内蒙古惠丰堂大药房连锁有限公司。将催情散制备成含生药1 g/mL的水煎剂：取催情散散剂315 g，混匀后装入自制药袋中，再将药袋放入煎药器中，加水浸泡2 h后加热煮沸。开始用武火，沸腾后改用文火，保持微沸30 min，趁热倒出药液，再加水同法煎药2次。将3次药液合并后浓缩成1 g/mL，4 ℃密封保存备用。灌胃时可依据试验设计的灌胃剂量及体积，对药液稀释后使用。

1.1.2 试验动物 健康昆明系雌性小鼠(约5周龄，体质量18～22 g)60只及健康雌性Wistar大鼠(约7周龄，体质量110～130 g)40只，由内蒙古大学动物实验中心提供，合格许可证号为SCXK(蒙)2016-0001号。试验前室温条件下常规饲养7 d，自由采食与饮水，每周更换3次垫料，观察健康状况。

1.1.3 主要仪器及试剂 BC-2800vet全自动血液细胞分析仪，北京曼程科技有限公司；奥林帕斯(OLYMPUS)系列的全自动生化分析仪、奥林帕斯(OLYMPUS)光学显微镜、SC-04型低速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司。天门冬氨酸氨基转移酶(AST，批号：140216017)、丙氨酸氨基转移酶(ALT，批号：140116022)、谷氨酰转移酶(r-GGT，批号：140916015)、碱性磷酸酶(ALP，批号：140316003)、总胆固醇(TC，批号：141616018)、葡萄糖(GLU，批号：141516018)、白蛋白(ALB，批号：140916013)、总蛋白(TP，批号：140816010)、尿素(UREA，批号：141316019)、肌酐(CREA，批号：141016003)试剂盒，均购自内蒙古精壹试剂耗材有限公司。灌胃针、一次性采血针及配套真空采血管，购自内蒙古呼和浩特市泽生试剂耗材有限公司。

1.2 半数致死量(LD50)的测定

取健康雌性昆明小鼠60只，随机平均分为6组，1～5组为试验组，第6组为对照组，各组小鼠禁食8 h后灌胃给药，给药4 h后复食，试验组按组间剂量比为1∶0.8 一次性灌胃给药，第1～5组的给药剂量分别为20 000，16 000，12 800，10 240和8 192 mg/kg，对照组灌服等体积的自来水，各组小鼠药液灌胃体积为每20 g体质量 0.4 mL。小鼠给药后常规饲养7 d，逐日观察精神、食欲、饮水及其活动情况，记录中毒症状、死亡时间和数目，并对死亡动物及时剖检、记录眼观病理变化，按改良寇式法计算LD50[7]。如小鼠未出现死亡，且无法继续给药(测不出LD50)[8-12]，需进行最大耐受量试验[13]。

1.3 最大耐受量试验

取雌性小鼠 20只 ，分为给药组与对照组，每组10只，禁食8 h(不禁水)。试验组小鼠于12 h内分3次灌服1 g/mL催情散药液，每次灌胃体积为每20 g体质量0.8 mL(最大灌胃体积)；对照组小鼠灌服等体积的自来水。小鼠灌胃后常规饲养7 d，逐日观察小鼠精神、食欲、饮水及其活动情况，记录小鼠的中毒症状、死亡时间及数目，并计算最大耐受量及耐受倍数，之后颈椎脱臼处死小鼠并剖检，观察2组小鼠的心、肝、脾、胃、肺、肾、卵巢、子宫等器官有无肉眼可见的病理变化[14-15]。小鼠的最大耐受量倍数=(小鼠耐受药量/小鼠平均体质量)×(奶牛平均体质量/奶牛每天用药量)，其中奶牛平均体质量取450 kg/头，奶牛每天用药量取临床推荐量315 g。

1.4 亚慢性毒性试验

取雌性大鼠40只，随机平均分为催情散高、中、低剂量给药组和对照组，高、中、低剂量给药组灌胃剂量分别为10 000，5 000和2 500 mg/kg，每天1次，对照组每日定时灌服等体积自来水。各组连续灌胃30 d(每7 d称一次体质量调整灌胃体积)，整个试验期间，每天早晚观察并记录动物的行为情况、外观体征、有无中毒反应以及死亡情况等[16]。给药期结束后各组大鼠心脏采血，检测血常规和血液生化指标。

1.4.1 体质量的测定 于灌药前及给药第7，14，21，28和30天，测定并记录大鼠体质量[17]。

1.4.2 血常规及血液生化指标的测定 采用全自动血液细胞分析仪测定血液的主要生理指标，包括血红蛋白(HGB)含量、红细胞数目(RBC)、白细胞数目(WBC)及各类白细胞(淋巴细胞(Lym)、单核细胞(Mon)、中性粒细胞(Neu)、嗜酸性粒细胞(Eo)、嗜碱性粒细胞(Ba))占白细胞总数的比例。分离血清后采用自动血液生化指标分析仪测定血液生化指标，包括天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、谷氨酰转移酶(r-GGT)、碱性磷酸酶(ALP)活性及总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)含量和肌酐(CREA-J)、尿素(UREA)、葡萄糖(GLU)、总胆固醇(TC)浓度[18-19]。

1.4.3 病理变化观察及脏器系数的测定 4组大鼠采血后立即剖检，观察心、肝、脾、胃、肾、肺等器官的眼观病理变化，并对每组大白鼠的心、肝、脾、胃、肺、肾、卵巢、子宫器官称质量后用10%福尔马林固定，经不同梯度酒精脱水、浸蜡包埋后切片，HE染色后在光学显微镜下观察各器官组织病理学变化[20-23]，计算心、肝、脾、胃、肺、肾、卵巢、子宫等器官的脏器系数(脏器系数=脏器质量/体质量×100%)[24]。

1.5 数据处理

各项试验数据用“平均值±标准差”表示，应用SPSS 20.0进行各组数据间的差异显著性比较及统计与分析。

2 结果与分析

2.1 中药催情散的LD50

经口1次灌服给药后，各组小鼠由于灌胃应激会呆立2～3 min，之后精神状态逐步恢复正常，活动自如，皮毛光滑，排粪、排尿正常且无异常分泌物，无不良反应。连续观察7 d，各组小鼠精神、食欲、饮水、活动程度均无异常，经大体剖检和病理检查，主要脏器无异常变化。由本试验可知，按改良寇式法不能计算出该药物的LD50(LD50>20 000 mg/kg)，按毒理学评价标准及药物毒性分级标准，当LD50>16 000 mg/kg时，可认为该药物无毒性。由于受给药体积和药物浓度的限制，难以测出LD50，故进行小鼠的最大耐受量试验。

2.2 中药催情散的最大耐受量

小鼠于12 h内分3次最大体积连续灌服中药催情散后，试验组累计药量达到120 g/kg，2组小鼠在灌胃后由于灌胃应激出现蜷缩呆立、活动减少现象，5 min后活动和饮食情况恢复正常。经7 d观察未见死亡和异常状况，剖检后各器官未出现眼观病理变化。经计算，小鼠(体质量20 g/只)的最大耐受药量为2.4 g/只。小鼠灌服催情散的最大耐受量倍数=2.4/20×450 000/315=171.5，即按体质量计算小鼠1 d最大耐受量是奶牛临床推荐剂量的171.5 倍，而此剂量下小鼠未出现异常变化，说明中药催情散按临床推荐剂量使用对奶牛是安全的。

2.3 中药催情散的亚慢性毒性

2.3.1 一般状况观察及体质量的测定 试验期间4个处理组大鼠除在前3 d有灌胃应激，但不到3 min就可恢复正常状态。除此之外，整个灌胃期间大鼠精神状态、活动程度和饮食情况均无异常变化，排粪、排尿正常，无异常分泌物。由表1可知，3个催情散剂量组大鼠体质量与对照组相比差异不显著(P>0.05)，说明催情散水煎剂对大鼠生长发育无明显影响。

表1 不同剂量催情散对大鼠体质量的影响Table 1 Effect of different doses on weight of rats g/只

2.3.2 血常规及血液生化指标检查 由表2，3可知，各组大鼠血常规和血液生化指标均无显著差异(P>0.05)，说明催情散口服灌药过程中，对血常规及肝、肾功能无明显影响。

表2 不同剂量催情散对大鼠血常规的影响 Table 2 Effect of different doses on blood routine examination of rats

表3 不同剂量催情散对大鼠血液生化指标的影响Table 3 Effect of different doses on blood biochemical indexes of rats

2.3.3 病理剖检变化及脏器系数 由表4可知，4个处理组大鼠各脏器系数均无显著差异(P>0.05)，表明中药催情散对大鼠各器官组织无实质性损害。

表4 不同剂量催情散对大鼠脏器系数的影响Table 4 Effect of different doses on organ coefficients of rats %

2.3.4 组织病理学变化 将催情散高、中、低剂量组和对照组大鼠各组织于光学显微镜(400倍)下观察，其中高剂量组和对照组大鼠心、卵巢的观察结果见图1。

A.高剂量组:箭头示心肌纤维坏死；B.对照组:上方箭头示间质血管出血，下方箭头示心肌纤维坏死;C.高剂量组:卵泡结构清晰无病变；D.对照组:卵巢髓质皮质无异常变化A.High dose group:the arrow shows myocardial fiber necrosis;B.Control group:the above arrow shows interstitial vascular hemorrhage,and the bottom arrow shows myocardial fiber necrosis;C.High dose group:follicle structure clearly no pathological changes;D.Control group:no abnormal change in ovarian medulla and cortex图1 催情散高剂量组和对照组大鼠心脏、卵巢的切片观察结果(HE染色，×400)Fig.1 Heart and ovarian slice observation of mice in high dose group and control group (HE stain，×400)

显微观察显示，各组大鼠心肌细胞排列整齐，心内膜、心外膜结构清晰，有部分心肌纤维坏死、间质血管出血，这是大鼠心脏采血所致；肝小叶由以中央静脉为中心放射排列的肝板组成且肝细胞完整，肝小叶间的界限可以分清但不明显，小叶内及汇管区未见坏死和炎性细胞浸润，胆管未见异常；脾脏实质无异常变化，白髓、红髓及小梁、淋巴小结和静脉窦结构清晰可见，未见明显异常变化；肺内支气管、肺泡结构清晰完整，各级支气管及周围肺泡间隔未见变性坏死，支气管腔及肺泡腔内未见炎性渗出物；肾脏组织形态结构完整，肾单位清晰可见，肾小球及肾小管未见异常变化，肾小囊腔内未见炎性渗出物和细胞浸润，近曲、远曲小管及集合管结构完整，未见异常变化；胃组织的黏膜层完整，黏膜下层、肌层组织清晰且未见异常变化，表层黏液细胞、颈黏液细胞及主细胞结构完整，未见炎性变化；子宫组织完整，子宫内膜及内膜腺未见异常变化，子宫肌层未见坏死，血管层内未见充血等异常变化；卵巢髓质、皮质形态完整，卵母细胞的细胞核、细胞质、放射冠及颗粒细胞清晰可见，未见异常变化，部分大鼠卵巢皮质部可见完整的黄体组织，说明本试验中药对大鼠的主要脏器和靶器官无毒性作用。

3 讨 论

3.1 中药催情散的急性毒性评价

急性毒性是新药安全性评价的重要指标。本试验中，急性毒性试验因受药液质量浓度及灌胃体积的影响，无法计算出该药物的LD50，按毒理学评价标准及药物毒性分级标准，LD50>16 000 mg/kg时可认为该药物无毒性[25]，据此可判断催情散无毒。根据中国新兽药研发规范与申报指南，对无法测出LD50的药物需分析其最大耐受量，一般检测动物单次或一天内2～3次服用最大剂量药物后的反应[15]。本试验中，小鼠经3次最大剂量药液灌服后的累积剂量达到120 g/kg，并且2组小鼠1周内未见异常变化，剖检后各脏器均无眼观病理变化。按体质量计算小鼠1 d最大耐受量是奶牛每天临床推荐剂量的171.5倍，而此剂量下小鼠未出现异常变化，说明中药催情散按临床推荐剂量使用对奶牛是安全的[26]。

3.2 中药催情散的亚慢性毒性评价

本药物的亚慢性毒性评价以连续30 d灌服不同剂量催情散后大鼠的反应和相应指标变化为依据。试验结果显示，3个剂量组大鼠的体质量、血常规、血液生化指标及脏器系数与对照组相比差异不显著(P>0.05)，各脏器除了因心脏采血导致部分心肌纤维坏死和间质血管出血外，再无其他异常变化,表明该药物按临床推荐剂量使用不会对受试动物产生慢性毒性作用。

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