肽类探针在胃肠道肿瘤荧光分子成像中的应用

张 娜，刘海峰

目前，癌症依然是人类健康的重大威胁之一。2018年最新发布的全球癌症统计结果显示，虽然胃癌和结直肠肿瘤的发病率有所下降，但其在癌症相关死亡原因中依然排在前列[1]。早发现、早诊断、早治疗是降低胃肠道肿瘤发病率和病死率的主要措施。传统的消化道肿瘤诊断模式是通过普通白光内镜发现可疑病变再进行随机活检，但由于早期消化道肿瘤缺乏典型的形态学改变，肿瘤病变分布不均一及活检的局限性，很容易造成误诊和漏诊[2]。因分子影像学可在细胞和分子水平上发现病变，实现疾病的早期诊断而得到迅速发展。光学分子成像属于分子影像学的一个分支，相对于其他成像技术，其具有无辐射、低成本、可重复性高等优点。高效的光学分子成像离不开良好的光敏剂，即荧光探针。目前，研究的荧光探针主要包括抗体、抗体片段、肽类、纳米粒子、“智能”活化探针及核酸适体探针[3]。肽类探针因其固有的优势得到很大发展。虽然目前筛查肽种类很多，但应用于胃肠道肿瘤的靶向肽较少，故本文主要对用于胃肠道肿瘤荧光分子成像的肽类探针进行总结和分析。

1 肽类探针的筛选

自从1985年美国Missouri大学George P. Smith[4]发现大肠杆菌Escherichia coli（E.coli）丝状噬菌体经加工修饰后，可在某些噬菌体外壳蛋白的末端显示外来氨基酸序列而不影响噬菌体感染活性及繁殖能力后，噬菌体展示技术在生物学领域得到了广泛应用。该生物技术原理是将外源目的蛋白的脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）序列插入到噬菌体外壳蛋白的基因中，外源基因随外壳蛋白的表达而表达，从而使外源蛋白表达于噬菌体表面。随着噬菌体展示技术及相关组合化学的实现，基于肽类探针的分子成像得到迅速发展，成为促进肿瘤分子成像和诊断发展的经济、迅速、有效的方法[5]。

噬菌体展示文库筛选技术通常是指通过体外培养的细胞，采用原位或在体方式利用靶分子在展示文库中筛选带有所需片段的噬菌体进行回收。利用该技术最终筛选出的噬菌体仍具有传染性，并可通过感染新鲜的宿主细菌进行繁殖和克隆。外源肽的一级结构可通过测序病毒DNA中的肽编码序列进行确定。亲和选择过程通常需最少四轮以获得与靶分子有效结合的噬菌体，其成功的关键取决于筛选过程的严格性。如果相对于结合所需靶标的稀有噬菌体具有优越的生长优势，则会在整个选择过程中繁殖不相关的噬菌体，导致在亲和选择程序中可能会损失最好的结合噬菌体。因此，严格的洗涤和噬菌体洗脱条件至关重要。用过量的游离靶标或配体竞争洗脱是洗脱特异性噬菌体的方法之一。在培养细胞，原位和体内选择中，靶标是未知的，因此只能使用非特异性洗脱程序。这些非特异性洗脱物由极端pH值、高离子强度、还原剂和洗涤剂组成，不足以破坏噬菌体与靶标之间的相互作用。此外，有研究表明，超声也可在体外改善噬菌体从靶标的洗脱[6]。另一个改善亲和选择成功的方法是在整个实验中控制好洗涤条件。对于体外筛选，目前已有严格和可控的洗涤条件，包括在大孔凝胶上的选择和洗涤或色谱淘选[7]。Liu等[8]开发了一种微流体装置，包括制造的铁磁结构，以允许捕获和释放磁珠，这有助于利用高流体力来控制清洗。总之，进一步完善筛选过程的质控可有利于肽类探针的发展。

2 肽类探针实验与临床相关研究

肽是一种可与病变组织特异性结合的氨基酸片段，用荧光基团标记后可用于荧光成像。各类探针的优缺点比较见表1。相对抗体来说，肽类探针具有分子量小、免疫原性小、高亲和力、高选择性、易化学修饰和良好的药物动力学性能等特点[9,10]。相对于纳米类探针来说，肽类探针合成过程简单且具有更高的生物安全性，这些优势均有利于推动肽类荧光探针在临床的应用。

2.1胃肿瘤及癌前病变 目前，关于胃癌的特异性靶点较少，因此用于胃癌荧光分子成像研究的肽类探针较少。Hui等[11]利用噬菌体库筛选技术筛选出了环形九肽CGNSNPKSC，简称GX1，可与人胃癌血管内皮细胞特异性结合。Xin等[12]用新合成的花青染料CyIC标记GX1，构建了探针 CyIC-GX1，并在小鼠胃癌移植瘤肿瘤模型中进行了研究，结果显示CyIC-GX1可与肿瘤组织发生特异结合，肿瘤部位荧光信号强度明显高于周围正常组织，且荧光持续时间较长。Liu等[9]从噬菌体库中筛选出环形七肽CTKNSYLMC，简称GEBP11，该肽也可与胃癌组织血管内皮细胞发生特异性结合，利用异硫氰酸荧光素（flourescein isothiocyanate，FITC）标记，构建FITC-GEBP11，用于小鼠胃癌移植瘤模型及人离体组织标本研究。该探针经尾静脉注射24 h后进行共聚焦激光显微内镜（confocal laser endomicroscopy，CLE）小鼠在体成像，结果显示肿瘤组织显示明显高于周围正常组织的荧光信号；此外，利用探针FITC-GEBP11与新鲜的人胃癌离体组织标本共同孵育30 min后进行CLE成像，结果显示93%（26/28）的胃癌离体组织标本显示不同强度的荧光信号。Zhang等[13]从噬菌体库中筛选出了靶向CD44的短肽RP-1，在细胞水平证明RP-1可与CD44阳性的胃癌肿瘤细胞发生特异性结合。Hwang等[14]筛选出可与肝细胞生长因子（cMet蛋白）稳定结合的环形肽aML5-FL，同样利用小鼠胃癌移植瘤模型证明了该探针与肿瘤组织的特异性结合。目前尚无用于胃癌在体研究的探针，其研究水平仍仅限于动物肿瘤模型，且肽类探针的安全性有待进一步研究。

2.2结直肠肿瘤及癌前病变 近年来，多数研究利用小鼠肿瘤模型或人离体组织标本进行了荧光分子成像研究。Liu等[15]使用Cy5.5标记筛选出来的可与结肠不典型增生性病变特异性结合的八肽QPIHPNNM构建探针Cy5.5-QPIHPNNM进行小鼠肿瘤模型在体研究。发现在体局部应用5 min后病变组织可见明显荧光信号，且明显高于对照组，表明该探针可有效区分肿瘤组织和正常组织。整合素是细胞表面跨膜糖蛋白，与细胞黏附、细胞信号通路有关，也是肿瘤重要靶点之一。整合素αvβ3在肿瘤血管生成、细胞转移中扮演重要角色，有75%的结直肠癌（colorectal cancer，CRC）存在αvβ3高表达。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（arginine-glycine-aspartic acid，RGD）是 一 种 靶 向 α5β1、α8β1、αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8和αⅡbβ3 的短肽[16,17]。Verbeek等[18]使用近红外荧光染料ZW800-1标记cRGD，构建探针cRGD-ZW800-1，对鼠结直肠癌移植瘤模型经尾静脉注射1 nm探针24 h后进行荧光成像，结果显示肿瘤组织荧光信号明显高于正常组织，此外与单纯的染料ZW800-1相比，背景干扰信号明显降低，但唯一不足的是静脉应用该探针的作用时间较长。R01是一种经化学合成的特异性靶向αvβ6的胱氨酸结肽，Rabinsky等[19]筛选出可特异性靶向紧密连接蛋白-1（Claudin-1）的七肽RTSPSSR，利用Cy5.5标记后用于荧光成像，结果显示该探针能很好的靶向结肠锯齿状腺瘤和肿瘤组织（锯齿状腺瘤一直被认为是检出率极低的癌前病变）。Zhou等[20]筛选出可与表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）胞外区第2结构域特异性结合肽QRHKPRE，荧光标记构建探针Cy5.5-QRHKPRE用于人离体组织标本免疫荧光成像，结果显示该探针敏感度达90%，特异度达93%。Zhang等[21]使用荧光染料A740标记R01，构建探针A740-R01，发现小鼠尾静脉注射探针1 h后肿瘤组织特异性荧光信号信噪比可达（8.27±0.87）。

表1 荧光分子成像的各类探针优缺点对比

除上述动物肿瘤模型研究，目前也有少数探针已完成人在体成像研究。Burggraaf等[22]从M13噬菌体库中筛选出可与人酪氨酸激酶c-Met特异性结合的环形肽序列 GE-137（AGSCYCSGPPRFECWCYETEGTGGGK），用花青染料Cy5**标记后对15名结直肠癌高危患者进行在体成像研究，发现靶向荧光探针结合荧光成像（122处）对病变的检出数与白光内镜（101处病变）相比多出21处，有29%的腺瘤在WL/FI双模式下被检出，其中有19%的病变只能利用荧光成像才能观察到，表明荧光成像能进一步提高肿瘤检出率，更重要的是，该探针的使用在短期内对人体并未产生明显的不良反应。此外，Joshi等[23]的研究结果也证明了荧光分子成像可有效提高早期病变的检出率。

2.3其他应用研究 有研究表明，肽类探针在动物在体成像方面具有良好的成像效果。此外，利用噬菌体库筛选出来的肽不仅可用于肿瘤组织成像，还可用于肿瘤靶向治疗。Hu等[24]使用筛选出来的血管靶向肽GX1与肿瘤毒素结合构建GX1-rmhTNF用于胃癌的靶向治疗研究，结果显示GX1-rmhTNF具有很好的抗肿瘤潜能，不仅可增加rmhTNF在肿瘤部位的聚集，同时也能减少肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）对机体的不良反应。因此，未来可将肿瘤组织成像与治疗相结合，利用肽类探针实现肿瘤在体诊疗一体化。

单一的成像模式总是会存在一定不足，多模态成像可取长补短，进一步提高肿瘤成像效果。Yan等[25]利用探针Fe3O4-GX1-Cy5.5同时进行磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）和光学双模态成像，将MRI高分辨率的组织学成像和光学成像高灵敏度的功能成像结合来提高胃癌的早期诊断率，结果显示多模态成像可有效地提高肿瘤分辨率。

3 展 望

随着噬菌体库技术的发展，更多的肽类探针被筛选出来，并在肿瘤分子成像领域显示出广阔的应用前景。此外分子成像与内镜技术相结合对消化道肿瘤的诊断与治疗也具有重要的临床意义。如今关于肽类探针的研究虽取得可观的结果，但目前仍存在以下不足：（1）虽然短肽探针通过与靶细胞特异性结合可进行疾病的诊断，但在肽类探针的筛选与应用方面，除目前明确的作用位点整合素和c-Met外，多数肽类探针的作用靶点未知，且肽序列未显示受体配体同源性，可能对人体具有潜在毒性；（2）肽类探针不能同时用于肿瘤的治疗，或许可结合免疫治疗，实现肿瘤诊疗一体化；（3）目前用于胃肠道肿瘤靶向肽的缺乏也从另一方面反映了肿瘤发生发展的复杂性及肿瘤标志物的缺乏，未来仍需更多的努力去研究肿瘤的发生与发展机制以及肿瘤特异性抗原的筛查。此外，多模态成像和诊疗一体化也是未来分子成像领域重要的发展方向之一。

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