云南省大理地区HPV亚型分布研究

赵立仙 毕磊 杨锡彤 王光明 何举

[摘要] 目的 通过分析体检人群人乳头瘤病毒（HPV）的感染情况，以了解云南省大理地区HPV的感染特点。 方法 选取2013年1月～2015年11月大理大学第一附属医院体检中心接诊的女性患者2912例，根据随机数字表法分为13型组（1587例）和21型组（1325例）。其中13型组应用荧光探针法进行13种高危型HPV检测，21型组应用分子导流杂交技术进行21型HPV亚型检测，并对两种检测技术的结果进行比较分析。 结果 13型组中，检测出含HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等13种高危亚型的阳性患者206例，阳性率为12.98%（206/1587）；21型组中，检测出阳性患者246例，阳性率为18.57%（246/1325）；共检出除低危型HPV43型外的20种亚型；在20种HPV亚型感染中，HPV16型阳性率最高为29.67%（73/246），其次为HPV52亚型21.14%（52/246）。 结论 云南省大理地区HPV的感染分布具有异质性，两种检测方法的检出率无差异，检测方法的选择应该根据临床需要进行选择。

[关键词] 人乳头瘤病毒；分子导流杂交；荧光探针法；宫颈癌

[中图分类号] R737.33 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）03（a）-0131-04

[Abstract] Objective To understand the characteristics of human papillomavirus （HPV） infection in Dali region of yunnan province by analysis of the infection of HPV in the population of physical examination. Methods From January 2013 to November 2015， 2912 female patients received in Medical Examination Center of the First Affiliated Hospital of Dali University were selected， and divided into 13 type group （1587 cases） and 21 type group （1325 cases） according to the random number table. 13 type group was used to 13 types of high risk HPV detection by real-time PCR， 21 type group was used to type 21 HPV subtype detection by molecular hybridization， and the results of two kinds of detection techniques are compared and analyzed. Results In the 13 type group， a total of 206 cases of positive patients with 13 high-risk subtypes including HPV16， 18， 31， 33， 35， 39， 45， 51， 52， 56， 58， 59 and 68 were detected，with a positive rate of 12.98%（206/1587）. In the 21 type group， 246 cases were infected with HPV， with the positive rate of 18.57% （246/1325）. A total of 20 subtypes except low-risk HPV43 were detected. The most common HPV genotypes were HPV16 with the positive rate of 29.67%（73/246）. Second， HPV52 subtype 21.14% （52/246） in 20 types of HPV subtypes. Conclusion The infection of HPV in Dali region， Yunnan Province， has heterogeneity. The detection rate of the two detection methods was not different， and the selection of the detection method should be selected according to the clinical needs.

[Key words] Human papillomavirus； Molecular hybridization； Real-time PCR； Cervical carcinoma

宮颈癌是成年女性第二大常见恶性肿瘤[1-2]，流行病学研究发现人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）可以在几乎所有宫颈癌的标本中找到[3]，进一步研究显示HPV感染持续8～24个月将引起宫颈上皮内瘤变，8～12年后可发展为宫颈癌[3-4]，并且HPV多重感染的患者组织中与宫颈癌发生相关的蛋白CyclinB1、CyclinD1、CDK1、CDK6、Bcl-2、Bcl-xl、Survivin比单一感染的患者高[5]，因此针对成年女性进行HPV检测显得尤为重要。目前商业化的HPV检测试剂盒主要包括HPV病毒载量检测和HPV分型检测。本研选取云南省大理大学第一附属医院（以下简称“我院”）体检的2912例患者，分别用13种高危型HPV检测试剂盒与21型HPV检测试剂盒检测患者的HPV感染情况，从而了解大理地区HPV的感染特点以及两种试剂盒检测的优缺点，以便对HPV感染防治提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013年1月～2015年11月我院体检中心接诊的女性患者2912例，根据随机数字表法分为13型组（1587例）和21型组（1325例）。其中13型组年龄17～74岁，平均（39.90±8.37）岁，年龄分布：≤20岁4例，>20～30岁163例，>30～40岁618例，>40～50岁625例，>50～60岁145例，>60岁32例；21型组年龄17～76岁，平均（40.24±8.03）岁，年龄分布：≤20岁2例，>20～30岁119例，>30～40岁487例，>40～50岁570例，>50～60岁126例，>60岁21例，两组患者年龄等一般资料比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。本研究通过我院医学伦理委员会审批，患者及患者家属均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 13型组 由妇科的专业人员用妇科专用阴道窥器和毛刷刷取宫颈脱落细胞，然后保存在试剂盒专用的保存液中，进行13种高危型HPV检测。13种高危型HPV型检测流程：参照凯普生物科技有限公司“13种高危型HPV核酸检查试剂盒”的说明书进行操作，即宫颈脱落细胞DNA提取，然后PCR扩增（每次扩增实验均设置阳性和阴性对照各1个），扩增体系为：PCR混合物17.5 μL，DNA聚合酶0.5 μL，样品2 μL；扩增条件：95℃预变性10 min，94℃ 10 s，58℃ 50 s，45个循环，38℃ 5 s，检查结束后从系统中调取患者的HPV检查数据作为分析对象。

1.2.2 21型组 由妇科的专业人员用妇科专用阴道窥器和毛刷刷取宫颈脱落细胞，然后保存在试剂盒专用的保存液中，进行21型HPV检测。HPV21型检测流程：参照凯普生物科技有限公司“HPV核酸扩增分型检测试剂盒”的说明书进行操作，即宫颈脱落细胞DNA提取，然后PCR扩增（每次扩增实验均设置阳性和阴性对照各1个），扩增体系为：PCR混合物23.25 μL，DNA聚合酶0.75 μL，样品1 μL；扩增条件：95℃预变性9 min，94℃ 20 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，40个循环，72℃ 5 min。PCR扩增结束后用杂交仪进行导流杂交，杂交结束后进行酶标显色，然后参照说明书判断检测样本的基因型，在拟分析的时间段的检查结束后，从检测系统中提取患者HPV数据进行分析。

1.2.3 仪器和试剂 PCR仪和杂交仪（荧光定量基因扩增仪即PCR检测系统为TL988型和扩增后进行杂交用PCR基因扩增热循环仪，型号为DTC型）由西安天隆科技有限公司提供，荧光探针法和导流杂交的相关试剂由广州凯普生物科技有限公司提供。13种高危型HPV检测试剂盒检测涵盖包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等13种亚型；21型HPV检测试剂盒检测包括HPV16、18、31、33、35、39、43、45、51、52、53、56、58、59、66、68等16种高危型别和HPV6、11、42、44，CP8304（81）等5种低危型别组成的21种亚型。

1.3 统计学方法

采用SPSS 10.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准（x±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 13型组HPV感染情况

13种高危型HPV感染阳性患者206例，阳性率为12.98%（206/1587）。各个年龄段的感染情况以≤20岁的感染率最高为50.00%（2/4），其次为>20～30岁的年龄段感染率19.02%（31/163），>50～60岁的年龄段阳性率最低11.03%（16/145），不同年龄段间HPV感染阳性率比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

2.2 21型组HPV感染情况

21型HPV感染阳性患者246例，陽性率为18.57%（246/1325）。如果排除13种高危型HPV检测试剂盒不能够检测的HPV43、53、66、6、11、42、44，CP8304（81）的8种亚型外，阳性率为16.30%（216/1325）。各个年龄段的感染情况以>20～30岁的感染率最高，为38.66%（46/119），其次为>30～40岁的年龄段感染率19.51%（95/487），>50～60岁的年龄段阳性率最低10.32%（13/126），不同年龄段间HPV感染阳性率比较，差异无统计学意义（P > 0.05），见表1。与13种高危型HPV检出效率比较，差异无统计学意义（P=0.187）。

2.3 高危亚型和低危亚型感染情况

21型HPV感染阳性的246患者中，高危亚型感染229例，占阳性患者的93.09%（229/246）；低危亚型感染30例，占阳性患者的12.20%（30/246）；高危、低危亚型混合感染13例，占阳性患者的5.28%（13/246）。在21型HPV感染阳性患者中，单一感染201例，占81.71%（201/246）；2种亚型感染37例，占15.04%（37/246）；3种亚型以上感染8例，占3.25%（8/246），其中单个患者最多混合感染亚型为4种亚型，仅仅1例。

2.4 HPV亚型感染分布

在21种HPV感染的246例阳性患者中，HPV16亚型是高危亚型感染最高的型别，阳性率为29.67%（73/246），其次HPV52亚型为21.14%（52/246）；低危亚型感染中以HPV81亚型最高，为6.10%（15/246），各种亚型的感染情况。见表2。

3 讨论

宫颈癌主要由高危亚型HPV持续感染后，宫颈上皮发生病理改变而形成[6-9]。大量的临床和基础研究及其循证医学的Meta分析均发现，HPV感染，尤其是高危型感染与宫颈癌的发生密切相关。因此要达到宫颈癌的早期发现和诊治，HPV检测就显得尤为重要[10]。由于宫颈癌的发生、发展与遗传异质性密切相关[7，11]，而云南省大理地区HPV感染相关的数据报道较少，因此对大理地区居民的HPV感染情况进行研究。

HPV检测包括HPV载量检测和HPV分型检测。在本研究中，利用13种高危型HPV检测试剂盒检测了1587例患者病毒载量，阳性率为12.98%（206/1587）；而利用21型HPV检测试剂盒检测了1325例患者的感染亚型，阳性率为18.57%（246/1325），如果排除13种高危型HPV检测试剂盒不能够检测的HPV43、53、66、6、11、42、44，CP8304（81）八种亚型外，阳性率为16.30%（216/1325），两种检测方法在检出效率方面无差异（P > 0.05）。

国内相关文献报道，子宫颈癌的发病高峰为>35～39岁和>60～64岁[12-13]，而本研究结果提示：13种高危型HPV检测的结果为≤20岁的感染率最高为50%（2/4），其次为>20～30岁年龄段的感染率19.02%（31/163），而21种HPV感染检测中以>20～30岁的感染率最高38.66%（46/119），其次为>30～40岁年龄段的感染率19.51%（95/487），两种检测技术均显示>20～30岁为高发年龄，与我国其他地区HPV感染的高发年龄相比，年龄偏低[14-16]。由于≤20岁年龄的患者较少，因此其感染率不能够代表该地区该年龄段的感染情况。大理地区HPV感染的高发年龄与中国HPV感染的高峰年龄不完全一致，可能与该地区的地域差异有关。

利用21型HPV试剂盒对大理地区的人群的研究发现，高危亚型感染最多的是HPV16亚型，阳性率为29.67%（73/246），其次为HPV52亚型为21.14%（52/246）；低危亚型感染中，感染率最高的是HPV81亚型为6.10%（15/246），而中国人群最常见的HPV基因型为HPV16、53和CP8304，大理地区的HPV感染型别表现出一定的地域特点，该感染特点也与国内的其他地区、以及与东南亚、南非等地的感染优势亚型不完全相同[4，5，12，13，15]。因此本研究说明HPV感染率的高低、以及不同地区HPV感染的型别具有一定的异质性，其原因可能是病毒因素、宿主因素和环境因素交互作用的结果[2，17-18]。因此在临床治疗以及疫苗研发和应用上，针对临床目的的不同，以选择不同的取材方式、检测方式及其亚型的分布[19-20]。

综上所述，云南省大理地区13种高危亚型HPV的感染率、21种HPV的感染率以及两种检测方法所得到的各个年龄段的感染率均与其他地方基本相同；但是在21种HPV检测得到的结果提示具有一定的特异性，因此在HPV检测中两种方法的选择应该以临床的需要进行选择，抗病毒治疗，那么需要得到病毒载量的改变情况，选择13种高危型HPV检测，如果需要进行HPV疫苗治疗，那么应该选择21种HPV检测。

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