微小RNA-30b-3p在肝脏缺血再灌注损伤小鼠肝组织中的表达及意义

赵延兵，张 玮，苏瑜恒，李世朋，王 振

(1.焦作市人民医院普外科二区，河南 焦作 454002；2.新乡医学院第一临床学院肝脏疾病研究实验室，河南 卫辉 453100；3.天津市器官移植重点实验室，天津 300192)

肝脏缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury，IRI)多见于肝脏外科手术操作过程中[1]，可直接影响术后患者的预后、手术成功率甚至生存率。寻找保护缺血肝细胞的关键靶点，减少IRI的发生，是亟待解决的临床课题[2]。微小RNA30b-3p(microRNA30b-3p，miR-30b-3p)是miR-30家族中重要一员，在多种病理生理过程中起到调控作用[3]。本课题组前期研究发现，miR-30b-5p可抑制肝细胞自噬活性而减轻肝脏IRI[4]，miR-30b-3p与miR-30b-5p关系密切，但miR-30b-3p参与肝脏损伤与修复的研究尚未见报道。本研究通过观察miR-30b-3p在小鼠肝脏缺血再灌注中的表达及作用，旨在为肝脏IRI的防治提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组无特定病原体级雄性健康C57BL/6小鼠40只，5～6周龄，体质量20～23 g，购自军事医学研究所动物供应中心，随机分为IRI组、假手术组、miRNA阴性对照(miRNA negative control，miR-NC)组和miR-30b-3p agomir组，每组10只。所有小鼠喂以标准饲料，自由摄食、饮水。

1.2主要试剂与仪器miR-30b-3p agomir、miR-NC购自广州锐博生物公司，兔源抗鼠一抗Bcl-2、Fas相关死亡域蛋白(Fas-associated with death domain protein，FADD)、Bax、Caspase-3、Cleave Caspase-3、β-actin、羊抗兔二抗购自美国Cell Signaling Technology公司，实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)试剂盒、荧光脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法检测(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling,TUNEL)试剂盒购自德国Roche公司，miRNA专用提取试剂盒、miRNA专用反转录试剂盒、聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)、Tris-HCl-Tween缓冲盐溶液(Tris-HCl-Tween phosphate buffer saline，TBST)、放射免疫沉淀测定 (radioimmunoprecipitation assay，RIPA)裂解液、二辛可酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白测定试剂盒、氧化二氨基联苯胺(3,3′-diaminobenzidine，DAB)组织化学染色试剂套装均购自天津麦兰波公司；蛋白印迹电转系统购自美国Bio-Rad公司，qRT-PCR仪购自德国Roche公司，组织蜡块切片机购自德国Leica公司，G-BOX显影仪购自英国Syngene公司，TD-24K离心机购自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，BS-220全自动生物化学分析仪购自深圳迈瑞医疗国际股份有限公司。

1.3实验方法

1.3.1小鼠肝脏IRI模型制备各组小鼠建模前24 h禁食，不禁水；IRI组、miR-NC组及miR-30b-3p agomir组小鼠使用水合氯醛麻醉，从小鼠腹正中做切口，暴露腹腔脏器，用血管夹夹闭肝左、中叶脉管干(约占全肝2/3的肝脏缺血)，缺血1 h后松开血管夹，完成后关腹，再灌注时间为12 h[5]，miR-NC组和miR-30b-3p agomir组小鼠建立模型前24 h分别经尾静脉注射10 nmol·L-1的miR-NC[4]或miR-30b-3p agomir 0.3 mL；假手术组小鼠仅进行开腹及关腹等操作，不进行脉管夹闭。

1.3.2小鼠血清丙氨酸氨基转移酶(alanineaminotransferase，ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(aspartictransaminase，AST)水平检测建模处理完成后处死小鼠，经下腔静脉取血1 mL，常温静置6 h，然后使用TD-24K离心机3 000 r·min-1离心15 min后取血清，采用BS-220全自动生物化学分析仪检测血清ALT、AST水平。

1.3.3苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色观察小鼠肝组织病理学变化取各组小鼠肝脏组织，采用体积分数4%中性甲醛溶液固定，梯度乙醇(体积分数70%、80%、90%、95%、100%)脱水，二甲苯透明，制作组织石蜡标本，并将肝脏石蜡标本进行连续切片，63 ℃烤片，然后脱蜡、水化，苏木精染色15 min，盐酸乙醇溶液分化5 s，氨水溶液返蓝 1 min，伊红染色5 min，然后脱水、透明、封片，在显微镜下观察并拍照。

1.3.4免疫组织化学法检测各组小鼠肝组织中Caspase-3表达将肝组织石蜡标本作连续切片，63 ℃烤片，然后脱蜡、水化、体积分数3%H2O2孵育 22 min，微波炉抗原修复12 min，然后自然缓慢冷却至室温。加一抗(Caspase-3)，4 ℃下湿盒中孵育过夜。滴加含有二抗的工作液，显色试剂盒显色，然后复染、脱水、透明、封片，在显微镜下观察并拍照。采用Image J软件检测Caspase-3染色相对灰度值。

1.3.5荧光TUNEL法检测肝细胞凋亡石蜡切片常规脱蜡、水化，按照TUNEL操作说明处理切片，然后再滴加TUNEL反应混合液，37 ℃下避光湿盒孵育1 h。滴加DAPI溶液后在荧光显微镜下拍摄图片，采用Image J软件计算细胞核为红色的细胞所占百分率。

1.3.6qRT-PCR检测肝组织中miR-30b-3p表达使用miRNA专用提取试剂盒提取肝组织miRNA，然后进行反转录。采用嵌合荧光法行qRT-PCR，以U6为内参，miR-30b-3p上游引物序列为5′-GCTGCGGTGTAGACATCTAATAC-3′，下游引物序列为5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGACG-3′；U6上游引物序列为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列为5′-AACGCTTCAC-GAATTTGCGT-3′，按照qRT-PCR试剂盒说明书配置PCR体系，然后上机，测定循环阈值(cycle threshold,CT)。目的基因定量=2-△△CT，其中△△CT=△CT实验组-△CT对照组，△CT=CTmiR-30b-3p-CTU6。

1.3.7Westernblot检测小鼠肝组织中Bcl-2、FADD、Bax和CleaveCaspase-3蛋白的表达将新鲜的肝组织匀浆，RIPA裂解液裂解后收集各组细胞的总蛋白，采用BCA蛋白测定试剂盒测定总蛋白量。然后经电泳、转膜、封闭，加一抗(Bcl-2、FADD、Bax、Cleave Caspase-3与β-actin，稀释比例12 000)，4 ℃环境下孵育过夜。TBST洗涤后，加二抗(13 500)室温孵育1 h，滴加化学发光液进行化学发光反应，在G-BOX仪下显影、拍照，然后利用Imag J软件检测各蛋白相对表达量。

2 结果

2.14组小鼠肝组织病理学变化假手术组小鼠肝脏组织学形态正常，无病理学改变(图1A)；IRI组小鼠的肝组织中可见部分区域肝细胞水肿，甚至气球样变，中央静脉充血和点灶状坏死，且嗜中性粒细胞浸润较多(图1B)。miR-NC组小鼠肝组织中可观察到肝细胞水肿或气球样变，中央静脉充血和点灶状坏死，且嗜中性粒细胞浸润较多(图1C)；miR-30b-3p agomir组小鼠肝组织中可观察到肝细胞水肿明显减轻，中央静脉无充血，点灶状坏死明显减少，无嗜中性粒细胞浸润(图1D)。

A：假手术组；B：IRI组；C：miR-NC组；D：miR-30b-3p agomir组。

图1各组小鼠肝组织病理学变化(HE染色，×400)

Fig.1Pathologicalchangesofthelivertissuesofmiceineachgroup(HEstaining，×400)

2.24组小鼠血清ALT、AST水平比较结果见表1。IRI组和miR-NC组小鼠血清ALT、AST水平显著高于假手术组，差异均有统计学意义(P<0.05)；miR-30b-3p agomir组与假手术组小鼠血清ALT、AST水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；miR-30b-3p agomir组小鼠血清ALT、AST水平显著低于IRI组，差异有统计学意义(P<0.05)；miR-NC组与IRI组小鼠血清ALT、AST水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；miR-30b-3p agomir组小鼠血清ALT、AST水平显著低于miR-NC组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表14组小鼠血清ALT、AST水平比较

组别nALT/(U·L-1)AST/(U·L-1)假手术组1089.7±24.5108.0±33.4IRI组10365.8±68.9a478.5±98.7amiR-NC组10377.3±86.3a422.0±114.5amiR-30b-3pagomir组10113.3±75.6bc171.7±77.8bc

注：与假手术组比较aP<0.05；与IRI组比较bP<0.05；与miR-NC组比较cP<0.05。

2.34组小鼠肝组织中miR-30b-3p相对表达量比较假手术组、IRI组、miR-NC组和miR-30b-3p agomir组小鼠肝组织中miR-30b-3p相对表达量分别为9.6±2.3、3.3±1.6、4.5±2.8、12.7±2.5。与假手术组比较，IRI组、miR-NC组小鼠肝组织中miR-30b-3p相对表达量显著降低，miR-30b-3p agomir组小鼠肝组织中miR-30b-3p相对表达量显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。miR-30b-3p agomir组小鼠肝组织中miR-30b-3p相对表达量显著高于IRI组，差异有统计学意义(P<0.05)；miR-NC组与IRI组小鼠肝组织中miR-30b-3p相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。miR-30b-3p agomir组小鼠肝组织中miR-30b-3p相对表达量显著高于miR-NC组，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.44组小鼠肝细胞凋亡率比较结果见图2。假手术组、IRI组、miR-NC组和miR-30b-3p agomir组小鼠肝细胞凋亡率分别为(10.3±6.6)%、(42.8±8.1)%、(40.5±7.3)%、(13.3±5.6)%。IRI组和miR-NC组小鼠肝细胞凋亡率显著高于假手术组，差异有统计学意义(P<0.05)；miR-30b-3p agomir组与假手术组小鼠肝细胞凋亡率比较差异无统计学意义(P>0.05)。miR-30b-3p agomir组小鼠肝细胞凋亡率显著低于IRI组，差异有统计学意义(P<0.05)；miR-NC组与IRI组小鼠肝细胞凋亡率比较差异无统计学意义(P>0.05)。miR-30b-3p agomir组小鼠肝细胞凋亡率显著低于miR-NC组，差异有统计学意义(P<0.05)。

A：假手术组；B：IRI组；C：miR-NC组；D：miR-30b-3p agomir组。

图24组小鼠肝细胞凋亡情况(TUNEL，×400)

Fig.2Hepatocyteapoptosisofmiceinthefourgroups(TUNEL，×400)

2.54组小鼠肝组织中Caspase-3相对表达量比较Caspase-3在肝细胞的细胞质内呈棕黄色，假手术组小鼠肝组织中Caspase-3阳性染色强度较弱(图3A)，IRI组与miR-NC组小鼠肝组织Caspase-3 阳性染色强度较明显(图3B、3C)，而miR-30b-3p agomir组小鼠肝组织中Caspase-3阳性染色强度较弱(图3D)。假手术组、IRI组、miR-NC组和miR-30b-3p agomir组小鼠肝组织中Caspase-3相对表达量分别为46.4±8.1、177.7±24.5、193.7±20.3、48.3±7.9。IRI组和miR-NC组小鼠肝组织中Caspase-3 相对表达量显著高于假手术组，差异有统计学意义(P<0.05)；miR-30b-3p agomir组与假手术组小鼠肝组织中Caspase-3相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。miR-30b-3p agomir组小鼠肝组织中Caspase-3相对表达量显著低于IRI组，差异有统计学意义(P<0.05)；miR-NC组与IRI组小鼠肝组织中Caspase-3相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)；miR-30b-3p agomir组小鼠肝组织中Caspase-3相对表达量显著低于miR-NC组，差异有统计学意义(P<0.05)。

A：假手术组；B：IRI组；C：miR-NC组；D：miR-30b-3p agomir组。

图34组小鼠肝组织中Caspase-3表达(免疫组织化学，×400)

Fig.3ExpressionofCaspase-3inlivertissuesofmiceinthefourgroups(immunohistochemistry，×400)

2.64组小鼠肝组织中Bcl-2、FADD、Bax和CleaveCaspase-3蛋白表达比较结果见图4和表2。与假手术组比较，IRI组、miR-NC组小鼠肝组织中FADD、Bax及Cleave Caspase-3蛋白相对表达量显著增加，Bcl-2蛋白相对表达量显著减少，差异均有统计学意义(P<0.05)；miR-30b-3p agomir组与假手术组小鼠肝组织中FADD、Bax、Cleave Caspase-3及Bcl-2蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。与IRI组比较，miR-30b-3p agomir组小鼠肝组织中FADD、Bax及Cleave Caspase-3蛋白相对表达量显著降低，Bcl-2蛋白相对表达量显著增加，差异均有统计学意义(P<0.05)；miR-NC组与IRI组小鼠肝组织中FADD、Bax、Cleave Caspase-3及Bcl-2蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。与miR-NC组比较，miR-30b-3p agomir组小鼠肝组织中FADD、Bax及Cleave Caspase-3蛋白相对表达量均显著降低，Bcl-2蛋白相对表达量显著增加，差异均有统计学意义(P<0.05)。

A：假手术组；B：IRI组；C：miR-NC组；D：miR-30b-3p agomir组。

图44组小鼠肝组织中Bcl-2、FADD、Bax及CleaveCaspase-3蛋白表达(Westernblot)

Fig.4ExpressionofBcl-2，FADD，BaxandCleaveCaspase-3proteininlivertissuesofmiceinthefourgroups(Westernblot)

表24组小鼠肝组织中FADD、Bax、CleaveCaspase-3及Bcl-2蛋白相对表达量比较

组别nFADDBaxCleaveCaspase-3Bcl-2假手术组100.73±0.210.24±0.090.15±0.081.76±0.32IRI组101.09±0.27a0.52±0.14a0.99±0.14a0.27±0.11amiR-NC组101.23±0.25a0.75±0.15a1.15±0.32a0.36±0.12amiR-30b-3pagomir组100.86±0.09bc0.25±0.07bc0.12±0.06bc0.66±0.08bc

注：与假手术组比较aP<0.05；与IRI组比较bP<0.05；与miR-NC组比较cP<0.05。

3 讨论

肝脏IRI主要发生于肝切除、肝移植与创伤过程中，是影响肝外科手术后预后的主要原因之一，而其产生的机制尚不清楚[6]。miRNA是一类内源性的序列较短且不参与RNA编码过程的小分子RNA，其作用模式是与其靶基因的信使RNA互补配对，从而抑制该信使RNA的翻译，是一类在基因的转录翻译中起转录后调节作用的非编码RNA，通过对靶基因进行转录后表达的调控，在生物的发育、繁殖、细胞分化凋亡、致病机制方面发挥重要作用[7-9]。近年有研究表明，miRNA有希望成为临床治疗的潜在新靶点[10]。miRNA并不能翻译成相应的多肽或蛋白质，而是在机体生理活动过程中起着多种调控作用，其与细胞增殖与凋亡、新陈代谢、组织损伤修复等过程的调控有密切关系[11-13]。研究显示，miRNA在不同器官组织缺血再灌注过程中的表达水平有显著差异[14]，提示IRI的发生与miRNA水平变化存在一定关联。miR-30b-3p是miR-30家族中重要一员，其作用机制在肿瘤领域的研究报道较多，如抑制内源性miR-30b-3p和miR-30d-5p表达，可促进前列腺癌细胞生长[3]。而miR-30b-3p在肝脏IRI过程中的表达及作用尚未见报道。在本研究中，小鼠肝脏经缺血再灌注处理后，肝组织中出现嗜中性粒细胞浸润、肝细胞水肿，甚至出现坏死等病理改变，且小鼠血清ALT、AST水平均显著升高，表明缺血再灌注处理可使肝脏出现损伤；同时IRI组小鼠肝组织中miR-30b-3p相对表达量显著降低，而凋亡相关蛋白FADD、Bax及Cleave Caspase-3表达量显著增加，提示miR-30b-3p可能参与肝脏IRI过程。小鼠经miR-30b-3p agomir预处理后肝细胞水肿显著减轻，中央静脉无充血，点灶状坏死明显减少，无嗜中性粒细胞浸润，同时小鼠血清ALT、AST水平均显著下降，提示miR-30b-3p预处理可以减轻小鼠肝IRI。

肝细胞损伤后的恶性结局主要是坏死和凋亡。坏死其实是一种应对外部损伤时所引发的非程序性细胞死亡，可引发炎症反应；而细胞凋亡为I型程序性细胞死亡，是为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序死亡。如肾IRI过程中，凋亡信号分子被激活，进而诱导肾脏细胞凋亡[15]。细胞凋亡调控的分子机制主要通过依赖Caspase的经典凋亡和非依赖性Caspase细胞程序性死亡2种形式[16]。在外在或内在因素作用下，Caspase依赖的细胞凋亡信号通路或自杀相关因子/自杀相关因子配体信号通路被激活，可进一步活化FADD、Caspase-8等下游分子[17]；与此同时，抗凋亡相关蛋白Bcl-2亦参与了细胞凋亡过程[18]，而Bax和Bcl-2蛋白平衡状态决定了细胞是否凋亡[19-20]。Bcl-2作为抗凋亡调控的主要分子，在调控细胞凋亡信号方面有举足轻重的作用[21]。当细胞受到内外因素刺激时，FADD蛋白激活无活性的Caspase-3 蛋白酶原，裂解成活性形式的Cleave Caspase-3蛋白酶，后者再作用于Caspase-7/8等，使它们发生逐级活化。Caspase酶被激活后，降解各自的多种死亡底物，调节Bax/Bcl-2蛋白平衡，引起DNA降解和细胞凋亡形态学改变，从而介导细胞凋亡过程[16]。本研究结果表明，与miR-NC组比较，miR-30b-3p agomir组小鼠肝细胞凋亡率下降，且小鼠肝组织中Caspase-3 表达量显著减少，提示miR-30b-3p预处理可抑制缺血再灌注处理诱导的小鼠肝组织中Caspase-3表达，同时FADD、Bax及Cleave Caspase-3蛋白表达量亦显著减少，而抗凋亡相关蛋白Bcl-2表达量显著增加，提示miR-30b-3p预处理可抑制诱导的Caspase-3凋亡通路活化，减少肝细胞凋亡，从而减轻小鼠肝IRI。

综上所述，肝脏经缺血再灌注处理后，肝组织中FADD蛋白表达增加，继而激活Caspase-3，并改变 Bax/Bcl-2蛋白平衡，从而介导肝细胞凋亡，最终导致肝损伤；而miR-30b-3p预处理可以抑制FADD/Caspase-3信号通路所介导的肝细胞凋亡，从而改善肝IRI。miR-30b-3p可作为保护缺血肝细胞的分子靶点。

参考文献：

[1] LIN Y Z，LU Z Y，LIANG X H，etal.Effect of breviscapine against hepatic ischemia reperfusion injury[J].JSurgRes，2016，203(2)：268-274.

[2] COVINGTON S M，BAULER L D，TOLEDO-PEREYRA L H.Akt：a therapeutic target in hepatic ischemia-reperfusion injury[J].JInvestSurg，2017，30(1)：47-55.

[3] KUMAR B，KHALEGHZADEGAN S，MEARS B，etal.Identification of miR-30b-3p and miR-30d-5p as direct regulators of androgen receptor signaling in prostate cancer by complementary functional microRNA library screening[J].Oncotarget，2016，7(45)：72593-72607.

[4] LI S P，HE J D，WANG Z，etal.miR-30b inhibits autophagy to alleviate hepatic ischemia-reperfusion injury via decreasing the Atg12-Atg5 conjugate[J].WorldJGastroenterol，2016，22(18)：4501-4514.

[5] 麻勇，汪大伟，刘连新，等.小鼠肝脏部分缺血再灌注损伤模型的建立[J].中华消化外科杂志，2013，12(9)：703-707.

[6] 刘国岩，荚卫东，许戈良，等.肝脏缺血再灌注损伤的机制及防治进展[J].国际外科学杂志，2013，40(1)：50-53.

[7] 刘云,周晓玉.微小RNA与肺发育及肺相关疾病的研究进展[J].中华实用儿科临床杂志,2015,30(22):1748-1750.

[8] THORBURN J,FRANKEL A E,THORBURN A.Regulation of HMGB1 release by autophagy[J].Autophagy,2009,5(2):247-249.

[9] 莫珍珍,周瑶,徐红,等.miRNA在哮喘小鼠肺组织及肥大细胞中的表达差异[J].中华实用儿科临床杂志,2015,30(21):1637-1639.

[10] ROZALSKI M，RUDNICKA L，SAMOCHOCKI Z.MiRNA in atopic dermatitis[J].PostepyDermatolAlergol，2016，33(3)：157-162.

[11] 王来娣，郑云，蒋拾贝，等.miRNA在脂代谢中的研究进展[J].动物营养学报，2013，25(7)：1446-1452.

[12] 郭臻，周宏灏，张伟.miRNA调控网络的遗传变异研究进展[J].中华医学遗传学杂志，2015，32(1)：109-112.

[13] 祝烨，宋鑫.miRNA与lncRNA的相互调控作用在肿瘤中的研究进展[J].基础医学与临床，2015，35(11)：1554-1558.

[14] ZHOU Y，CHEN Q，LEW K S，etal.Discovery of potential therapeutic miRNA targets in cardiac ischemia-reperfusion injury[J].JCardiovascPharmacolTher，2016，21(3)：296-309.

[15] 金小雪，吕艳霞.肾脏缺血再灌注损伤及其修复与细胞凋亡的关系研究进展[J].中华器官移植杂志，2012，33(10)：637-639.

[16] YANG Y，DU J，LIU F，etal.Role of caspase-3/E-cadherin in helicobacter pylori-induced apoptosis of gastric epithelial cells[J].Oncotarget，2017，8(35)：59204-59216.

[17] KONG X，LUO J，XU T，etal.Plumbagin enhances TRAIL-induced apoptosis of human leukemic Kasumi1 cells through upregulation of TRAIL death receptor expression，activation of caspase-8 and inhibition of cFLIP[J].OncolRep，2017，37(6)：3423-3432.

[18] KASAI S，SASAKI T，WATANABE A，etal.Bcl-2/Bcl-xL inhibitor ABT-737 sensitizes pancreatic ductal adenocarcinoma to paclitaxel-induced cell death[J].OncolLett，2017，14(1)：903-908.

[19] YANG Z，GENG Y，YAO Z，etal.Spatiotemporal expression of Bcl-2/Bax and neural cell apoptosis in the developing lumbosacral spinal cord of rat fetuses with anorectal malformations[J].NeurochemRes，2017，42(11)：3160-3169.

[20] 石景鹤，高静，王家勤.拉莫三嗪对癫痫大鼠学习记忆能力及海马组织中Bax和Bcl-2蛋白表达的影响[J].新乡医学院学报，2017，34(1)：10-13.

[21] 赵学发，杨名慧，葛正龙.紫外线照射对SD大鼠晶状体上皮细胞p53、Bax、Bcl-2表达的影响[J].眼科新进展，2017，37(5)：423-427.