JWH-015预防给药对APP/PS1转基因小鼠学习记忆能力、神经源性炎症和神经可塑性的影响

李 超 史敬璞 史媛媛 贾慧群 李 锦 王 勃

(河北医科大学第四医院麻醉科，河北 石家庄 050017)

阿尔茨海默病(AD)俗称老年痴呆症，大量研究表明，β淀粉样蛋白(Aβ) 诱导产生的慢性神经源性炎症直接或间接影响神经再生能力、神经可塑性等学习记忆，与AD疾病发生及病程进展关系密切〔1,2〕。大麻素2型受体(CB2R)属于G蛋白耦联受体超家族，主要分布于外周免疫细胞和中枢神经系统内的小胶质细胞，在免疫炎症方面发挥重要调节作用。大量研究表明，在神经退行性疾病模型中，CB2R激动剂具有减轻神经源性炎症反应，改善认知功能损伤等神经保护作用〔3～5〕。但关于CB2R激动剂对AD疾病学习记忆密切相关的神经可塑性的影响研究较少。本研究通过观察长期选择性CB2R激动剂JWH-015预防给药对APP/PS1转基因小鼠空间认知功能、AD疾病脑内海马脑区慢性神经性炎症和神经可塑性的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 SPF级APP/PS1转基因鼠，购于美国JacksonLab实验室，由军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所新药评定实验室繁育饲养。实验小鼠分笼饲养于清洁级动物饲养房内，每笼10～15只，可自由摄食饮水，日光灯照明，每12 h进行明暗交替。

1.2主要试剂及仪器 JWH-015(批号041M4613V，美国Sigma公司)；刚果红染色试剂盒(批号SCBC2869，美国Sigma公司)；兔源抗离子型钙结合受体分子(Iba)1多克隆抗体(批号WEE4506，日本Wako公司)；鼠源抗胶质纤维酸性蛋白(GFAP)单克隆抗体(批号2898361，美国Millipore公司)；高尔基染色试剂盒(货号PK401，美国FD公司)；OCT组织包埋剂、荧光二抗(北京中杉金桥生物有限公司)。Morris水迷宫，北京鼎大生物科技公司；冰冻切片机(英国Leica公司)；荧光正置显微镜(日本Nikon公司)；VS120光学显微镜(日本Olympus公司)。

1.3实验方法

1.3.1动物分组及给药 实验分别选取健康的6月龄APP/PS1小鼠和同龄野生型(WT)小鼠，接受选择性CB2R激动剂JWH-015(CB1R的Ki值为383 nmol/L，CB2R为13.8 nmol/L)或对照溶剂(VEH)的处理，随机分为溶剂对照组(WT+VEH)、AD模型组(APP/PS1+VEH)、JWH-015处理组(APP/PS1+JWH-015)和JWH-015单药组(WT+JWH-015)。JWH-015处理组和JWH-015单药组小鼠接受连续8 w腹腔注射JWH-015 0.5 mg·kg-1·d-1，溶剂对照组和AD模型组腹腔注射等体积含有1%二甲基亚砜(DMSO)的生理盐水。

1.3.2Morris水迷宫实验检测小鼠定位航行能力 将小鼠分别从Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限边缘中点，面壁轻轻放入水中，自由探索60 s，记录小鼠成功登上水下隐藏平台的时间，即上台潜伏期。在60 s内登上隐藏平台并停留10 s者，视为成功登上平台；若未能成功登上平台的小鼠，则人工将其引导至平台，并停留10 s，其潜伏期记录为60 s。每天每只小鼠训练4次，训练的象限顺序随机且不同，计算每天4个象限的平均潜伏期。

1.3.3Morris水迷宫实验检测小鼠空间探索实验 第6天时去除第Ⅰ象限的水下平台，从第Ⅲ象限将小鼠放入水池内，记录60 s内小鼠穿越原隐藏平台位置的次数。

1.3.4免疫荧光实验检测神经源性炎症 采用50 mg/kg异戊巴比妥钠腹腔麻醉小鼠，用生理盐水和4%多聚甲醛由心灌流固定。取出小鼠脑组织，然后置入4%多聚甲醛液4℃固定过夜，OCT包裹后使用冰冻切片机，作20 μm厚冠状切面切片。采用免疫荧光法检测GFAP、Iba1的免疫荧光强度。取脑组织切片于pH6.0柠檬酸盐缓冲中进行高温热修复，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗后滴加稀释的一抗，4℃过夜；次日PBS清洗，滴加相应二抗，室温孵育1 h后PBS清洗，4′-6′-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染核后PBS清洗，滴加适量抗荧光猝灭封片剂，加盖玻片封片保存。各组选取相同位置的5张切片进行组织荧光染色，使用Nikon正置荧光显微镜于10倍物镜观察拍摄海马脑区图片，使用Image Pro Plus 7.0用于分析免疫荧光强度。

1.3.5高尔基染色检测神经可塑性 参照文献〔6〕，深麻醉下直接断头取脑，快速置于5 ml固定液中(A、B等体积混合液配制)，室温避光保存2 w；将脑组织转于5 ml C液处理，室温避光保存1 w；使用干冰预冷的异戊烷将脑组织速冻，切取厚约100 μm含海马脑区的冠状面切片；将切片浸泡于染色液(D液∶E液∶ddH2O=1∶1∶2，现用现配)中，室温避光孵育10 min；常规梯度酒精、二甲苯脱水、透明，中性树脂封片。使用VS120光学显微镜在60倍物镜下分别拍摄各组脑片。使用image pro plus 7.0医学图像分析系统测量海马齿状回(DG)区颗粒细胞单位树突长度内的棘突密度(为减少误差，统一选择选择第一分枝节点后树突分枝，长度至少50 μm)。每组小鼠从相同位置的脑区切片上选取30～45个神经元用于进行统计分析。

1.4统计学处理 采用Graphpad5.0软件进行方差分析、t检验。

2 结 果

2.1CB2R激动剂JWH-015对各组小鼠空间学习记忆能力的影响 如表1所示，随着训练天数的增加，各组小鼠上台潜伏期不同程度的下降。AD模型组第5天上台潜伏期和第6天穿台次数较溶剂对照组分别延长36.4%和减少50.6%，差异有统计学意义(均P<0.05)。JWH-015处理组小鼠第5天上台潜伏期较AD模型组缩短25.5%，差异有统计学意义(P<0.05)；图1为各组小鼠定位航行实验第5天的典型轨迹图。在第6天空间探索实验中，JWH-015处理组小鼠的穿台次数较AD模型组有增加的趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。各组小鼠每天的平均游泳速度差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表1 JWH-015对各组小鼠Morris水迷宫实验潜伏期和穿台次数的影响

与溶剂对照组比较：1)P<0.05；与AD模型组比较：2)P<0.05

图1 定位航行实验第5天各组小鼠典型轨迹图

2.2CB2R激动剂JWH-015对各组小鼠海马脑区Aβ斑块沉积数目的影响 刚果红染色结果显示，APP/PS1小鼠海马脑区均出现明显的Aβ斑块，呈浅红色点片状。而同龄WT小鼠海马脑区均未出现阳性染色斑块。见图2。AD模型组和JWH-015处理组小鼠海马脑区Aβ斑块数目分别为(5.30±0.69)个和(5.15±0.80)个，两组差异无统计学意义(P>0.05)，溶剂对照组与JWH-015单药组均无Aβ斑块。

图2 各组小鼠海马老年斑沉积的典型刚果红染色图片(×40)

表2 JWH-015对各组小鼠Morris水迷宫实验游泳速度的影响

2.3CB2R激动剂JWH-015对各组小鼠海马脑区胶质细胞免疫反应性的影响 星形胶质细胞免疫荧光染色中，AD模型组小鼠海马脑区GFAP免疫荧光强度与溶剂对照组、JM1-015处理组差异无统计学意义(P>0.05)。小胶质细胞免疫荧光染色中，AD模型组小鼠海马脑区内Iba1免疫荧光强度与溶剂对照组、JWH-015处理组差异有统计学意义(P<0.05)，见表3，图3。

2.4CB2R激动剂JWH-015对各组小鼠海马区神经可塑性的影响 溶剂对照组小鼠海马DG区锥体神经元棘突密度为〔(10.29±2.20)个/10 μm〕，而AD模型组为〔(9.01±2.30)个/10 μm〕，较溶剂对照组下降12.4%，差异有统计学意义(P<0.05)；而JWH-015处理组为〔(9.14±2.07)个/10 μm〕，与AD模型组〔(9.01±2.30)个/10 μm〕差异无统计学意义(P>0.05)，见图4。

表3 JWH-015对各组小鼠海马区GFAP及Iba1免疫荧光强度的影响

与AD模型组比较：1)P<0.05

图3 各组小鼠海马GFAP、Iba1免疫荧光示意图(×100)

A：海马DG区神经元高尔基染色(×400)，B：各组小鼠海马DG区神经元棘突的高尔基染色(×600)图4 高尔基染色结果

3 讨 论

CB2R在脑内主要分布于激活的小胶质细胞，并高表达于AD患者脑内，提示其作为脑内生理抗感染调节靶点的可能性〔6〕。本研究发现，8月龄APP/PS1转基因AD小鼠较同龄WT小鼠出现典型的空间学习记忆能力障碍。有文献报道，连续4个月CB2R激动剂JWH-133处理能够逆转老年APP2576转基因AD模型小鼠新奇物体识别能力的损伤〔7〕；另有报道，新型CB2R激动剂MDA7处理能够显著提高Aβ1～40海马注射AD模型Morris水迷宫的潜伏期与穿台次数表现〔6〕；而本研究显示，JWH-015预防性给药能够显著降低APP/PS1小鼠的潜伏期，但对穿台次数无显著性影响，与以往研究〔7〕结论有所不同。造成这一差异的原因除与模型动物、给药种类及处理时程有关外，主要可能与不同药物激动CB2R对AD小鼠脑内Aβ斑块沉积及神经源性炎症反应的影响程度不同有关。

Aβ斑块沉积和慢性神经源性炎症是AD的重要病理特点，也是AD学习记忆损伤与病情进展的重要原因。研究表明，CB2R激动剂JWH-133及MDA7处理能够促进AD小鼠脑内Aβ的清除、降低Aβ的沉积并减轻炎性细胞的反应性〔7〕。但本研究结果提示JWH-015预防给药改善AD模型小鼠空间学习记忆能力可能与调节海马脑区小胶质细胞免疫反应性有关。

神经可塑性是指感知各种内外源刺激后脑内神经元突触成分、轴突、棘突等发生结构功能调节的重要过程，是维持正常学习认知功能的重要方面。研究表明，Aβ蛋白的神经毒性作用和慢性神经源性炎症可以引起突触、神经元结构和功能异常，并导致进行性的学习记忆能力下降〔8～10〕。本研究结果提示神经可塑性降低可能是Aβ相关的神经源性炎症引发AD模型小鼠空间认知能力损伤的机制。尽管有文献报道，MDA7显著改善Aβ1～40海马注射AD模型小鼠海马CA1区长时程增强(LTP)〔6〕，但本研究中JWH-015预防性给药并未对AD模型小鼠海马DG区颗粒细胞棘突密度产生显著性影响。原因可能与CB2R激动剂对AD模型小鼠海马脑区的神经源性炎症的调节程度有关；而这也可能是JWH-015预防性处理未能完全逆转的AD模型组Morris水迷宫学习记忆能力损伤的原因，但有待于进一步研究。

综上，CB2R激动剂JWH-015对AD模型小鼠的空间学习记忆能力损伤有一定改善作用，其作用机制可能与海马区胶质细胞免疫反应性有关。

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