高效液相色谱法同时测定中成药红药片中5种成分

李 敏 ，赵 健 ，白钢钢 △

（1．江苏省泰州市食品药品检验所，江苏 泰州 225300； 2．武警安徽总队医院，安徽 合肥 230000）

中成药红药片由三七、红花、当归、川芎、白芷和土 鳖虫6味中药组成，具有活血止痛、祛瘀生新功效，临床主要用于跌打损伤、筋骨淤血肿痛、风湿麻木[1]。方中三七为主药，可散瘀止血、消肿定痛，临床主要用于各种内、外出血，胸腹刺痛，跌扑肿痛[2]。人参皂苷和三七皂苷是三七的生物活性成分，但在红药片部颁标准中无其含量测定项目。三七的含量测定有薄层扫描法、高效液相色谱（HPLC）-蒸发光散射测定法、HPLC法等，薄层扫描法的精密度和重复性均较差[3]，HPLC-蒸发光散射测定法在测定过程中不稳定。HPLC法更快速，分离效能高，结果准确可靠，重复性好，应用广泛，如2015年版《中国药典（一部）》中，三七药材的含量测定采用HPLC法测定人参皂苷Rg1，Rb1和三七皂苷R1的含量[2]。目前，关于红药片三七中皂苷类成分的HPLC法检测分析，大多以4个成分以下居多[4-7]，同时测定5个成分的报道相对较少，缺少对人参皂苷Rd的测定，且目前市场上有三七总皂苷对照品，相对于配制混合对照品，更简单、方便、快捷。为更好地控制中成药红药片的质量，保证临床用药的疗效，本研究中建立了中成药红药片5种主要生物活性成分的含量测定方法。现报道如下。

1 仪器与试药

1．1 仪器

Waters e2695型高效液相色谱仪，包括脱气泵、四元泵、自动进样器、2489UV紫外检测器；Empower色谱工作站；8200型超声波清洗器（功率为500 W，频率为53 kHz，上海科导超声仪器有限公司）；Milli-Q型超纯水处理系统（美国M ILLIPORE公司）；Mettler AE-200型电子天平(梅特勒公司）；Mettler XS105DU型电子天平（梅特勒公司）。

1．2 试药

红药片（抚顺青松药业有限公司，批号分别为20161104，20170402，20170521）；三七总皂苷对照品（批号为 110870-201603)，人参皂苷 Rg1(纯度为 28．0%)，人参皂苷 Re(纯度为 3．8%)，人参皂苷 Rb1(纯度为29．7%)，人参皂苷 Rd(纯度为 7．3%)，三七皂苷 R1(纯度为6．9%），均购于中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法

2．1 色谱条件

色谱柱：Waters XBridge C18柱（250 mm ×4．6 mm，3．5 μm）；柱温：25 ℃；流动相：A 为乙腈溶液，B 为水，梯度洗脱(0～20 min 20%A，20～45 min 20% ～46%A，45～55 min 46% ～55%A，55～60 min 55%A，60～65 min 55% ～20%A，65～80 min 20%A)；流速：0．8 mL ／min；检测波长：203 nm；进样量：10 μL。

2．2 溶液制备

取三七总皂苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每 1 mL 含三七皂苷 R128 μg、人参皂苷 Rg10．15 mg、人参皂苷 Re 15 μg、人参皂苷 Rb10．12 mg、人参皂苷Rd 30 μg的对照品溶液。取本品10片，研细，混匀，取约0．5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水饱和正丁醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率为500 W，频率为53 kHz）40 min，放冷，再称定质量，用水饱和的正丁醇溶液补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25 mL，置分液漏斗中，用正丁醇饱和的氨试液洗涤2次（25 mL，15 mL），弃去氨试液，再用正丁醇饱和的水洗涤 2次（25 mL，15 mL），弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣用甲醇溶解转移至10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。取缺三七药材的阴性样品，按供试品溶液项下方法制备，即得阴性对照品溶液。

2．3 方法学考察

专属性试验：取缺三七药材的阴性样品，依法制备溶液并进样测定，记录色谱图，结果阴性对照品溶液无干扰。详见图1。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察：取对照品溶液，分别进样2，5，8，10，12，15 μL，记录峰面积，计算回归方程，详见表 1。

表1 线性关系考察结果

精密度试验：取对照品溶液，连续进样6次，记录色谱峰面积值。结果的 RSD依次为 0．71%，0．23%，0．31%，0．18% ，0．60%(n ＝ 6)，表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取2．2项下同一供试品溶液，分别在0，2，4，6，8，10，12，16，20，24 h 时进样，记录峰面积。结果 5种成分峰面积的 RSD分别为 1．46%，1．08%，1．34%，0．90%，1．88%（n ＝10），表明供试品溶液在 24 h内稳定。

重复性试验：取同一批（批号20161104）样品6份，依法平行制备，测定。结果，三七皂苷R1及人参皂苷Rg1，Re，Rb1，Rd 每 片 平 均 含 量 分 别 为 0．20，0．88，0．096，0．58，0．16 mg， RSD 分别为 2．43% ，1．28% ，1．01%，1．66%，3．69%(n ＝ 6)，表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的同一批（批号20161104）样品，研细，称取 6 份，每份约 0．25 g，精密称定，分别加入三七皂苷 R1(0．070 g／L)、人参皂苷Rg1(0．28 g／L)、人 参 皂 苷 Re(0．039 g／L)、人 参 皂 苷Rb1(0．30 g ／L)、人参皂苷 Rd(0．074 g ／L)的对照品溶液3 mL，依法制备，测定。结果见表2。

表2 加样回收试验结果（n＝6）

2．4 样品含量测定

取3批样品，依法制备溶液并测定，按外标校正因子法计算含量。结果见表3。

表3 样品含量测定结果（mg，n＝4）

3 讨论

本研究中所测的人参皂苷类成分，在常温条件下稳定不易分解，可常温保存，但供试品溶液在蒸干过程中，温度蒸干，几乎没有三七总皂苷成分。三七皂苷类成分的稳定性相关的研究表明，高温对三七总皂苷的影响较大，在高温条件下，三七总皂苷极易分解，样品应密封，阴凉暗干燥处储存[4,8-9]。

本研究中对流动相系统进行了选择，分别对乙腈-0．05% 磷酸溶液（20 ∶80）[10]、乙腈 -0．1% 磷酸溶液(22 ∶78)[11]、甲醇 -水（55 ∶45），发现人参皂苷 Rg1和人参皂苷Re几乎很难分开，且人参皂苷Rd相对其他成分，极性小，出峰时间比较靠后，洗脱时间长，故应考虑梯度洗脱方法。参考2015年版《中国药典(一部)》三七药材含量测定的色谱条件，使用乙腈-水梯度洗脱，结果人参皂苷Rg1和人参皂苷Re分离度低，且人参皂苷Rd未分离出来。采用人参皂类成分多选用的乙腈-水为流动相[12]，梯度洗脱 115[13]，80，65 min[14]，结果梯度洗脱80 min时，出峰快，待测组分能和共存组分达到基线分离，基线平稳，且色谱峰具有较好的对称性，故选用80 min的梯度洗脱程序。

色谱条件的考察中，温度对人参皂苷类成分的影响也很大，温度高色谱峰会拖尾，温度低有的色谱峰会有前沿，最终确定色谱柱的最佳温度为25℃[15]。本研究中选择的色谱柱是 Waters XBridge C18柱（250 mm ×4．6 mm，3．5 μm），1．0 mL ／min 的流速在梯度洗脱中致色谱柱压力偏高。通过优化试验，最终采用0．8 mL／min的流速既满足柱压又符合分离要求。

为达到让样品有更大的提取效率，前处理过程分别对称样量和提取方式进行了考察。提取方式分别考察了加热回流(2 h)和超声处理2种[16]，发现超声处理含量明显偏高，说明三七总皂苷生物活性成分在前处理过程中应避免高温加热过程，故使用超声处理。分别比较超声 30，40，60 min，发现超声处理 40 min时提取效率最高，故超声处理 40 min。称样量分别称取约 0．2，0．3，0．4，0．5，0．7，1．0 g 样品，超声处理 40 min，结果称取约0．5 g时样品提取效率最佳。

综上所述，HPLC法同时测定中成药红药片中的三七皂苷 R1及人参皂苷 Rg1，Re，Rb1，Rd 的含量，各成分在80 min内检测完全，方法精密度、准确度，重复性好，对该制剂的质量控制具有重要意义。

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