大鼠脊髓损伤后 TIMP-2、Collagen I 和 Collagen IV的表达情况及其肢体运动功能的研究

2018-05-23李仁斌余光书林焱斌

中国骨与关节杂志 2018年5期

李仁斌余光书林焱斌

脊髓损伤 (spinal cord injury，SCI) 是严重的神经系统疾病，损伤后原有的血－脊髓屏障破坏，血管基膜裂解，微血管损伤，产生出血、水肿、炎症等病变，损伤患者多伴有下肢感觉和运动功能减退或消失[1-3]。目前，SCI 尚未有理想的治疗方法。基质金属蛋白酶组织抑制因子 (tissue inhibitor of metalloproteinase 2，TIMP-2) 作为一种内源性的酶类能够抑制细胞外基质 (extracellular matrix，ECM)的降解从而维持组织内环境的稳定[4]，故对 SCI 后组织修复所需环境的调控至关重要。I 型胶原蛋白(Collagen I) 主要来自哺乳动物成纤维细胞、软骨细胞等。研究表明[5]，Collagen I 在损伤后伤口愈合，

血管重建中发挥重要作用；IV 型胶原蛋白 (Collagen IV) 由血管内皮细胞分泌，在正常的神经系统中，存在于脑脊液和微血管周围，起组织连接作用[6-7]。

研究表明[8]，SCI 后 TIMP-2、Collagen I 和 Collagen IV 在某个时间内的表达持续升高，有利于损伤处血管的构建，基膜的重塑及轴突的生长，对 SCI 后肢体运动功能的恢复起重要作用。但三者在 SCI 后表达的变化趋势尚不清楚。本研究旨在观察大鼠 SCI后 TIMP-2、Collagen I 和 Collagen IV 的表达情况，探讨 TIMP-2，Collagen I 和 Collagen IV 对 SCI 模型大鼠肢体运动功能恢复所起的作用。

材料和方法

一、实验材料

1. 实验动物：60 只体重为 (220±20) g 的健康成年雌性 SD 大鼠，购于上海斯莱克实验动物责任有限公司，许可证号码为 SCXK (沪) 2014-006，饲养于福建中医药大学实验动物中心 SPF 级实验室。本研究符合福建中药大学动物实验伦理委员会要求。

2. 实验试剂：(1) 一抗：兔抗鼠 TIMP-2 抗体(Abcam，美国)、兔抗鼠 Collagen I 抗体 (Abcam，美国)、兔抗鼠 Collagen IV 抗体 (Abcam，美国)；(2) 二抗：山羊抗兔 Alexa flour488 荧光二抗(Thermo Fisher，美国)；(3) 尼氏染色试剂盒 (索莱宝、北京)、免疫组化试剂盒 (迈新，福州)。

3. 实验仪器：NYU 脊髓打击器 (W. M. Keck 神经科学协作中心，美国)、显微镜 (Leica DMI 4000B /DFC425C，德国)、Image-lab 图像分析系统、Image-Pro 图像分析系统 (BIORADHERCULES，美国)。

二、实验方法

1. 动物分组和造模：采用随机数表法将 60 只SD 大鼠随机分为假手术组、术后 3 天组、术后5 天组、术后 7 天组和术后 9 天组，每组 12 只。假手术组仅行椎板切除术，不损伤脊髓。其余各组均使用 NYU 脊髓打击器建立 SCI 模型[9]。大鼠麻醉成功后，取 T9～11区域进行脱毛，局部皮肤消毒，沿脊柱纵轴作一长约 2～3 cm 切口，依次切开皮肤、皮下组织、肌肉、筋膜，钝性剥离附着于棘突两侧的肌肉，暴露 T9～11椎骨棘突和椎板，咬除棘突和椎板，暴露 T10部位白色脊髓硬脊膜，将大鼠固定于NYU 打击器固定台，调整打击杆，使其瞄准 T10脊髓正中，调整打击杆高度为 12.5 mm，释放打击杆，使其自由下落撞击脊髓，出现大鼠尾部剧烈摆动，头部肌肉瞬间收缩，术后出现双下肢完全瘫痪，提示造模成功。造模成功后，生理盐水冲洗伤口后逐层缝合。术后每天早晚人工按摩膀胱和下腹以助大鼠排便排尿，每天进行青霉素 4 万单位 / 只前肢注射，连续 3 天，预防感染。

2. 行为学评分：本实验采用 BBB 肢体运动功能评分[10]评估假手术组大鼠和术后 9 天组大鼠肢体运动功能。由 2 名非本实验工作人员且熟练掌握 BBB评分标准的专业人员于造模后 1 天、3 天、5 天、7 天、9 天对每只大鼠独立进行 BBB 肢体运动功能评分，每只大鼠评分 2 次，且每次观察时间 ≥3 min。最终取平均评分。

3. 取材方法：水合氯醛麻醉成功后，将每组中的 6 只大鼠腹腔剪开，取血，止血钳夹住腹主动脉，打开胸腔，暴露心脏，然后于右心房、左心耳处各剪一小口，自左心尖部注入 150 ml 生理盐水快速冲洗，然后缓慢注入 150 ml 的 4% 多聚甲醛进行灌注固定，待大鼠肢体僵硬后以脊髓损伤处为中心，取长约 2 cm 脊髓段，置于 4% 多聚甲醛，4 ℃固定 48 h。每组剩余 6 只大鼠麻醉成功后，迅速以脊髓损伤处为中心，取长约 2 cm 脊髓段，放置于EP 管中，迅速放入液氮速冻，-80 ℃ 保存备用。

4. 检测方法：(1) 尼式染色：将厚度 5 μm 的石蜡切片常规脱蜡入水后放入尼氏染色液，置于 60 ℃温箱中浸染 50 min，蒸馏水迅速冲洗 3 遍，再用分色液分色 1～2 min (具体时间根据分色情况而定)，晾干，中性树胶封片，镜下观察，采集图片。(2)免疫组化染色：采用免疫组化试剂盒染色，具体步骤如下：酒精梯度脱蜡，纯水漂洗 1 min，微波枸橼酸钠抗原修复，放置常温中冷却至室温。PBS 漂洗3 次，每次 3 min。洗去 PBS，加入过氧化物酶阻断剂室温下孵育 10 min，PBS 洗 3 次，每次 3 min，除去 PBS，加入非免疫动物血清封闭 10 min，不洗，加入一抗 4 ℃ 孵育过夜。次日常温下复温 30 min，PBS 漂洗 3 次，每次 3 min，加入二抗室温孵育10 min，除去 PBS，加入链霉菌抗生物素－过氧化物酶溶液，室温下孵育 10 min，除去 PBS 液，DAB显色，显色时间根据光学显微镜下观察而定，自来水终止显色，苏木素复染 1 min，自来水返蓝 30 s，梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树脂透明封片。在光学显微镜下用低倍镜先定位，再用高倍镜观察。每个指标每个区域选择 6 个不重叠视野进行统计。(3) Western blot 检测：取 1 cm 脊髓剪碎，加裂解液，冰浴 60 min。14 000 g 离心 10 min，BCA法定量蛋白。各孔加入 200 µl BCA 工作液，于 37 ℃烤箱中放置 30 min。在酶标仪中测得标准曲线和吸光度，通过其算出蛋白浓度。蛋白变性后，将样品于相应浓度的 SDS-PAGE 凝胶电泳分离，待 Marker蛋白跑至玻璃板底部且样本蛋白基本呈一条直线沉于底部，则停止跑胶。转至 PVDF 膜封闭，TPBS 洗3 次。封闭液封闭 1.5 h，先后加入一抗二抗，每次步骤间隔均用 TBST 漂洗。用 TBST 清洗去除二抗后开始显影。将膜置于化学发光试剂中反应 1 min，在避光条件下显影，凝胶扫描成像系统进行分析。分别采用 TIMP-2、Collagen I 和 Collagen IV 与 β-actin的吸光度比值表示蛋白的相对表达量。

三、统计学处理

采用 SPSS 20.0 软件对数据进行统计学分析，实验数据采用± s 表示，符合正态分布的用t检验或单因素方差分析，非正态分布资料用秩和检验。BBB 评分不符合正态分布，采用秩和检验；免疫组化和 Western blot 检验符合正态分布，采用单因素方差分析进行比较。

结果

一、BBB 肢体运动功能评分

与假手术组相比，术后 9 天组 BBB 肢体运动功能评分显著下降。随着损伤后时间的推移，术后 9 天组的 BBB 肢体运动功能评分逐渐升高，与术后 1 天相比，术后 7 天和术后 9 天的大鼠肢体 BBB 运动功能评分升高，差异有统计学意义 (P＜0.05) (表1)。

表1 术后 BBB 评分 (± s)Tab.1 BBB score after surgery (± s)

注：与术后 1 天组相比，aP＜0.01Notice: Compared with the scores 1 day postoperatively, aP < 0.01

组别 n 术后 1 天术后 3 天术后 5 天术后 7 天术后 9 天假手术组 12 19.50±0.32 19.84±0.21 20.23±0.26 21.00±0.00 21.00±0.00术后 9 天组 12 0.58±0.15 0.83±0.21a 2.33±0.31a 4.42±0.38a 10.08±0.50a F 值 0.31 6.56 9.58 13.95 P 值 0.58 0.18 0.01 0.001

二、尼式染色

假手术组神经细胞结构完整、形态规则，呈饱满的梭形状，胞质内可见清晰的虎斑样尼氏体，尼氏体饱满，细胞核明显；SCI 各组神经细胞损伤严重，局部可见瘀血斑块，细胞水肿或碎裂，无细胞核，尼氏体萎缩或较小，神经细胞周围可见空泡样变，术后 9 天神经细胞形态有所改善，尼氏体较饱满，细胞水肿减轻 (图1)。

三、免疫组化染色

免疫组化结果发现假手术组未见明显的 TIMP-2、Collagen I 和 Collagen IV 表达。SCI 后 3 天即出现 TIMP-2、Collagen I 和 Collagen IV 的表达且表达量逐渐上升。TIMP-2 表达部位主要在神经元、胶质细胞、单核细胞；Collagen I 和 Collagen IV 弥散性表达于脊髓实质的基质成分中。SCI 各组的 TIMP-2 表达均高于假手术组，差异有统计学意义 (P＜0.05)；SCI 后 5 天 TIMP-2 表达最高，与其它时间点相比差异有统计学意义 (P＜0.05)；SCI 各组的 Collagen I和 Collagen IV 表达均高于假手术组，差异有统计学意义 (P＜0.05)；SCI 后 7 天 Collagen I 和 Collagen IV的表达最高，与其它时间点相比差异有统计学意义(P＜0.05) (表2，图2、3)。

四、Western blot

图1 尼氏染色观察各组脊髓神经元形态 (× 200) (注：黑色箭头所示为尼氏体，红色箭头所示为瘀血)Fig.1 Observation of spinal neuron morphology in each group by Nissl staining (× 200) (Notice: Black arrows showed the Nissl body and the red arrows showed the blood stasis)

图2 免疫组化观察各组 TIMP-2、Collagen I 和 Collagen IV 表达情况 (× 200) (注：红色箭头所指为阳性反应)Fig.2 Immunohistochemical observation of the expressions of TIMP-2, Collagen I and Collagen IV in each group (× 200) (Notice: Red arrows showed the positive reaction)

表2 各-组大鼠 TIMP-2、Collagen I 和 Collagen IV 表达平均光密度值 (± s)Tab.2 The mean optical -density of TIMP-2, Collagen I and Collagen IV in rats of each group (± s)

注：与假手术组相比，aP＜0.05；与术后其它组相比，bP＜0.05Notice: Compared with the sham group, aP < 0.05; Compared with other surgery groups, bP < 0.05

组别 n (只)TIMP-2 Collagen I Collagen IV假手术组 6 0.36±0.18 0.23±0.11 0.29±0.15术后 3 天组 6 0.56±0.13a 0.41±0.16a 0.43±0.11a术后 5 天组 6 0.78±0.11ab 0.50±0.19a 0.59±0.15a术后 7 天组 6 0.63±0.16a 0.77±0.17ab 0.79±0.13ab术后 9 天组 6 0.58±0.13a 0.52±0.13a 0.53±0.15a F 值 3.02 2.78 4.32 P 值 0.00 0.00 0.00

图3 TIMP-2、Collagen I 和 Collagen IV 相对表达量变化趋势Fig.3 Variation trend of relative expressions of TIMP-2, Collagen I and Collagen IV

Western blot 结果显示假手术组的 TIMP-2、Collagen I 和 Collagen IV 蛋白表达量较低。SCI 后TIMP-2、Collagen I 和 Collagen IV 蛋白表达量逐渐增高。SCI 各组中除术后 9 天组外，其它组的 TIMP-2 蛋白表达量均高于假手术组且差异有统计学意义(P＜0.05)；SCI 后 5 天 TIMP-2 蛋白表达量最高，与其它时间点相比差异有统计学意义 (P＜0.05)。SCI 各组 Collagen I 和 Collagen IV 的蛋白表达量均高于假手术组，且差异有统计学意义 (P＜0.05)；Collagen I 和 Collagen IV 蛋白表达量于 SCI 后 7 天最高，与其它时间点相比差异有统计学意义 (P＜0.05)(表3，图4、5)。

表3 各组大鼠 TIMP-2、Collagen I 和 Collagen IV 蛋白表达量(± s)Tab.3 The mean optical density of TIMP-2, Collagen I and Collagen IV in rats of each group (± s)

注：与假手术组相比，aP＜0.05；与术后其它组相比，bP＜0.05Notice: Compared with the sham group, aP < 0.05; Compared with other surgery groups, bP < 0.05

组别 n (只)TIMP-2 Collagen I Collagen IV假手术组 6 0.77±0.17 0.28±0.10 0.25±0.15术后 3 天组 6 0.82±0.16a 0.38±0.17a 0.39±0.13a术后 5 天组 6 0.92±0.12ab 0.53±0.18a 0.52±0.18a术后 7 天组 6 0.84±0.15a 0.54±0.17ab 0.57±0.16ab术后 9 天组 6 0.78±0.14a 0.39±0.16a 0.41±0.19a F 值 5.56 4.57 8.46 P 值 0.00 0.00 0.00

图4 各组 TIMP-2、Collagen I 和 Collagen IV 蛋白表达量 (注：与假手术组相比，aP ＜ 0.05；与术后其它组相比，bP ＜ 0.05)Fig.4 Protein expressions of TIMP-2, Collagen I and Collagen IV in each group (Notice: Compared with the sham group, aP ＜ 0.05;Compared with other surgery groups, bP ＜ 0.05)

图5 Western blot 检测各组 TIMP-2、Collagen I 和 Collagen IV蛋白表达情况Fig.5 Expressions of TIMP-2, Collagen I and Collagen IV in each group by Western blot

讨论

SCI 包括原发性损伤和继发性损伤，原发性损伤主要是由于脊髓受到机械性打击造成组织结构破坏，包括细胞死亡，细胞外基质间相互作用被切断，损伤局部出现水肿，血脊髓屏障被破坏，以及炎症发生，炎症细胞浸润和炎性因子浸润，内环境紊乱等，原发性损伤后，由于血脊髓屏障通透性增加，导致血管内物质大量外漏，进一步加剧出血、水肿、炎症等继发性损伤[1-3,11]。在本实验中随着时间的推移，SCI 大鼠的 BBB 评分结果提示损伤后7 天开始显著升高，说明其肢体功能障碍改善可能与炎症逐渐消散，内环境慢慢修复，出血和水肿进一步减轻有关。这也与相关实验结果与本实验结果相一致[12]。

TIMP-2 是一种可溶性的低分子量分泌型糖蛋白，其作为一种内源性的酶类，能够抑制 ECM 成分(如：胶原、明胶、蛋白多糖、基膜等) 的降解，在促进伤口修复，抑制炎性反应等过程中起到重要作用[4,13]。TIMP-2 不仅能抑制 ECM 成分的降解，同时，还能发挥细胞生长因子样作用，促进胶原蛋白生成及成肌纤维细胞的增生活化[14]。在本实验中，SCI 大鼠可见大量 TIMP-2 表达，并在术后 5 天达到高峰，可能的机制是 SCI 发生后原有血脊髓屏障发生破坏，维持脊髓组织中微血管内皮骨架结构血管基膜发生裂解，其完整性受到破坏，开始出现水肿，炎症，出血，缺氧，细胞凋亡，神经元受损等病理现象，TIMP-2 被激活并开始大量表达[2,8,11]。TIMP-2 维持在较高表达水平后，对 ECM 的降解发挥抑制作用，从而维持损伤内环境的稳定，有利于组织修复。但术后 5 天由于组织慢慢恢复，缺氧、缺血得到改善，对内皮细胞，神经元等的刺激也逐渐减弱，因此，TIMP-2 也不会被过度激活，其表达逐渐降低。TIMP-2 与 MMPs 相结合后形成酶原－TIMP 复合体，从而抑制 MMPs 的活性。在一般正常生理情况下，此二者的比例是保持一种动态平衡关系，从而维持着 ECM 有序的合成和降解。在病理状态下，二者的平衡被打破，如脊髓损伤后，炎症因子释放过多，基质大量被溶解，EMC 降解减少，因此造成积聚[15-17]。MMPs 被激活后，就能够发挥降解 EMC 的生物学作用。因此将其活性严格地控制在一定的程度，对维持机体的正常稳定状态具有重要的意义。

Collagen I 主要来自哺乳动物正常组织中真皮层，成纤维细胞、成骨细胞、成软骨细胞等，具有形成和保持骨与结缔组织的完整性的作用[18]。研究也表明，Collagen I 能够参与损伤血管的重新构建，与血管形成密切相关，同时在形成特定的细胞外微环境中也起到主要作用，而这些特定的细胞外微环境对于细胞生存，维持细胞完整性及细胞之间信号传递有着重要意义和作用[9,19]。此外，Collagen I 可以通过盘蛋白、整合素等向细胞内传递细胞外环境中的刺激信号，发挥其生物学功能；通过截留、保存、运输生长因子从而起到信号分子的作用[9,20]。这些功能在器官发育、伤口组织愈合与修复中发挥重要作用。在正常脊髓组织中，Collagen I 并无明显表达，SCI 后，由于出血，水肿等病理因素的刺激，Collagen I 开始表达[21]。

Collagen IV 作为 ECM 中基膜的主要组成组分，广泛分布于全身组织，起组织连接、促进损伤血管再生作用，对维持内环境的平衡稳定具有重要意义[22-24]。Collagen IV 在正常的中枢神经系统中，仅存在于微血管周围和脑脊膜中，由血管内皮细胞分泌并包绕血管内皮细胞，也是构成微血管管壁的主要成分之一，在脊髓实质中的其它部分并无明显表达[8]。当脊髓受到打击后，ECM 遭到破坏，基膜成分开始裂解，血管内皮细胞坏死、凋亡，Collagen IV 开始降解，但由于生理病理因素的影响，血管再生机制被很快激活，作为构成微血管主要成分的Collagen IV 开始大量合成，研究表明，SCI 早期，Collagen IV 的合成有利于阻碍炎症的发生[25]。

本研究发现术后 3 天 Collagen I、Collagen IV 开始明显表达，术后 7 天 Collagen I、Collagen IV 表达到最高峰，随后开始慢慢下降。其可能的机制为：SCI 后，TIMP-2，Collagen I、Collagen IV 开始表达，高表达的 TIMP-2 促进 Collagen IV 过度表达，同时过度表达的 Collagen IV 形成的某种机械屏障能限制轴突再生，从而阻碍神经功能的恢复，此时Collagen I 表达水平也并未很高，对组织的修复能力很弱。术后 5 天，TIMP-2 表达到最高峰随后开始下降，其对 Collagen IV 表达的促进作用减弱，Collagen IV 表达减少，机械屏障开始分解，神经正常的生理功能得以恢复，与此同时 Collagen I 在损伤后 7 天表达最高，其所发挥的血管重建，组织修复等作用也达到最高峰，所以 BBB 评分在损伤后 7 天显著升高。研究证明[26-27]，SCI 后过度表达的 Collagen IV形成的胶质瘢痕发挥机械屏障作用，能够限制轴突的再生与传导功能，从而影响神经功能的恢复。

本实验研究结果为治疗 SCI 提供一个新思路，即在损伤早期提高 Collagen I 的表达，通过调控TIMP-2 的表达，控制 Collagen IV 表达水平使其不形成胶质瘢痕的同时还能限制炎症反应。

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