河南省部分地区猪和鸡源粪肠球菌的分离鉴定与耐药性分析

李金磊，董 鹏，狄元冉，方忠意，高延玲，周红霞，吴志明

(河南省兽药饲料监察所，河南郑州 450008)

肠球菌原属于链球菌属，是一种革兰阳性菌，广泛分布于植物、地表水、土壤、蔬菜及动物等多种生物，对高温及恶劣环境有较强的耐受性[1-2]。肠球菌与多种食源性动物疫病有关，能引起猪腹泻，给养殖业造成重大损失，并威胁人的健康[3]。临床分离的肠球菌中，粪肠球菌约占80%～90%，而屎肠球菌只占5%～10%[4]。粪肠球菌是人和动物肠道中一种重要的条件致病菌，在畜牧业生产中常作为益生菌饲料添加剂来调节畜禽肠道菌群。但是，近年来由于抗生素的广泛使用，在兽医临床研究中，由肠球菌引起的动物疾病也日益增多[5-7]；在人类公共卫生安全上，粪肠球菌已成为医院感染的重要病原菌之一[8]，我国医院分离的病原菌中，粪肠球菌位居前3位[9]。作为可以衡量抗菌药物耐药性水平的革兰阳性指示菌，对猪、鸡源粪肠球菌的耐药性分析和研究具有重要意义，可以为科学制定抗菌感染防治方案及细菌耐药性监测提供必要的数据支持。本试验从河南省A、B、C、D 4个地区的规模化养猪、鸡场抽取样品，对粪肠球菌进行分离、鉴定，随后进行耐药性试验，以期掌握河南省猪、鸡源粪肠球菌的耐药情况，为指导临床合理用药和粪肠球菌的控制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 肠球菌标准菌株ATCC 29212，购自中国兽医药品监察所。

1.1.2 样品来源 2016年1月至2016年12月抽取河南省A、B、C、D 4个地区规模化养殖场猪、鸡肛门拭子样品480份，具体抽样数量见表1。

表1 样品抽样数量统计

1.1.3 培养基与试剂 革兰阳性细菌鉴定板，BD公司产品；一次性无菌采样棒(BHI)，郑州君越科莱特健康科技有限公司产品；KF链球菌琼脂培养基、营养琼脂、脑心浸液琼脂，北京路桥技术有限公司产品；革兰阳性细菌药敏板，天津市金章科技发展有限公司产品。

1.1.4 仪器设备 低温可叠放摇床(MaxQ SHKE6000-8CE)，Thermo公司产品；细菌浊度仪，北京中西远大产品；全自动细菌鉴定/药敏系统(BD PhoenixTM-100)；梯度PCR仪(MyCycle)、凝胶成像系统，Bio-Rad公司产品。

1.1.5 引物 粪肠球菌引物P1：5′-ACTTATGTGACTAACTTAACC-3′，P2：5′-TAATGGTGAATCTTGGTTTGG-3′，扩增片段长度为326 bp。

1.2 方法

1.2.1 预增菌 将一次性无菌采样棒采集的样品尽快送到实验室，37℃培养16 h～20 h，同时设阳性和阴性对照。

1.2.2 样品的分离、纯化 取预增菌菌液1环～2环，划线于KF链球菌琼脂培养基上，37℃培养48 h±2 h，选取单个典型菌落进行纯化，最后将纯化好的菌落划线接种于脑心浸液琼脂培养基。

1.2.3 菌株的鉴定

1.2.3.1 PCR鉴定 用灭菌棉签挑取纯化好的菌落，加入装有无菌生理盐水的1.5 mL离心管中，反复冷冻煮沸2次～3次，12 000 r/min离心取上清作为PCR扩增模板。同时设阳性对照、阴性对照和空白对照。

50 μL总反应体系为：预混酶25 μL，ddH2O 18 μL，P1 1 μL，P2 1 μL，模板5 μL。

反应条件为：95℃ 5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35个循环；72℃ 5 min；4℃结束反应。同时设置阳性对照、阴性对照和空白对照。

PCR结束后，取8 μL PCR产物，用15 g/L琼

脂糖进行电泳，15 V/cm电泳20 min～30 min，凝胶成像系统观察结果。

1.2.3.2 鉴定系统鉴定 对PCR鉴定为粪肠球菌阳性的样品，采用全自动细菌鉴定/药敏系统进一步鉴定。

1.2.4 药敏试验 取营养琼脂上经鉴定的粪肠球菌菌落，用生理盐水调制0.5 MCF，吸取10 μL加入到10 mL肉汤中，然后分别取100 μL加入到96孔药敏板中，37℃培养16 h～20 h，读取药敏试验结果。

2 结果

2.1 菌株分离结果

经预增菌培养，KF链球菌琼脂培养基分离纯化，最后经PCR及全自动细菌鉴定/药敏系统鉴定，河南地区规模化猪、鸡场共分离粪肠球菌254株，分离率为52.9%(254/480)，其中猪源粪肠球菌154株，分离率为51.3%(154/300)，鸡源粪肠球菌100株，分离率为55.6%(100/180)。具体情况见表2和图1。

表2 河南省各地区猪、鸡源粪肠球菌分离情况

M.DNA标准DL 2 000；P.阳性对照；N.阴性对照；K.空白对照；1～20.样品

M.DNA Marker DL 2 000;P.Positive control; N.Negative control; K.Blank control;1-20.Samples

图1河南省猪、鸡源粪肠球菌PCR鉴定部分结果

Fig.1 PCR identification results ofEnterococcusfaecalisisolated from pigs and chickens in Henan province

2.2 药敏试验结果

将分离菌株进行头孢西丁、克林霉素、泰妙菌素、磺胺异恶唑、红霉素、替米考星、头孢噻呋、强力霉素、青霉素、氟苯尼考、复方新诺明、氧氟沙星、恩诺沙星、庆大霉素、利萘唑胺、阿莫西林/克拉维酸、万古霉素等17种抗生素药物敏感性试验，分离的254株粪肠球菌对头孢西丁、克林霉素、泰妙菌素、磺胺异恶唑、红霉素、替米考星、头孢噻呋耐药较严重，耐药率分别为99.14%、98.71%、97.84%、96.12%、93.97%、93.97%、93.10%，对强力霉素(多西环素)、青霉素耐药相对严重，耐药率均在80%～90%，对万古霉素全部敏感。其中猪源粪肠球菌对头孢西丁、克林霉素、泰妙菌素、头孢噻呋、磺胺异恶唑、红霉素、替米考星、强力霉素等8种抗生素耐药严重，耐药率均在89%以上，鸡源粪肠球菌对克林霉素、泰妙菌素、青霉素、头孢西丁、磺胺异恶唑、替米考星、红霉素、头孢噻呋等8种抗生素耐药严重，耐药率均在89%以上。具体结果见表3～表5。

2.3 不同地区耐药结果

不同地区耐药结果存在差异，且具有统计学意义，总体来看，A地区对红霉素(P<0.05)、替米考星(P<0.05)、复方新诺明(P<0.01)、庆大霉素(P<0.01)耐药率明显高于其他3个地区，对青霉素(P<0.01)的耐药率明显低于其他3个地区；B地区对复方新诺明(P<0.01)的耐药率明显低于其他3个地区；C地区对氟苯尼考(P<0.05)耐药率明显低于其他3个地区；D地区对恩诺沙星(P<0.01)的耐药率明显低于其他3个地区。A地区猪源粪肠球菌对复方新诺明(P<0.05)、利萘唑胺(P<0.05)、庆大霉素(P<0.01)的耐药率明显高于其他3个地区，对青霉素(P<0.01)的耐药率明显低于其他地区。A地区鸡源粪肠球菌对氧氟沙星(P<0.01)、恩诺沙星(P<0.01)的耐药率明显高于其他3个地区；B地区鸡源粪肠球菌对复方新诺明(P<0.01)、氟苯尼考(P<0.01)的耐药率明显低于其他3个地区；D地区鸡源粪肠球菌对头孢噻呋(P<0.01)的耐药率明显低于其他3个地区。具体结果见表3～表5。

2.4 不同动物来源耐药结果

猪、鸡源粪肠球菌对头孢西丁、克林霉素、泰妙菌素、磺胺异恶唑、红霉素、替米考星、头孢噻呋的耐药率均超过88%，不同动物来源粪肠球菌对抗菌药物的耐药性存在差异，且具有统计学意义，猪源粪肠球菌对强力霉素(P<0.05)、氟苯尼考(P<0.01)、复方新诺明(P<0.01)、利萘唑胺(P<0.01)的耐药率明显高于鸡源粪肠球菌，对青霉素(P<0.01)、氧氟沙星(P<0.01)、恩诺沙星(P<0.01)的耐药率明显低于鸡源粪肠球菌。具体结果见表3～表5。

表3 河南省4个地区动物源粪肠球菌对17种抗菌药物的耐药结果

表4 河南省4个地区猪源粪肠球菌对17种抗菌药物的耐药结果

表5 河南4个地区省鸡源粪肠球菌对17种抗菌药物的耐药结果

2.5 多重耐药结果

总体来说，河南省粪肠球菌对7类及7类以上抗菌药物耐药率超过91%，猪源粪肠球菌对7类及7类以上抗菌药物耐药率超过89%，鸡源粪肠球菌对7类及7类以上抗菌药物耐药率为94%；其中对9类抗菌药物的多重耐药菌株所占的比重最多，总体、猪源、鸡源分别为35.43%、34.42%和37.00%。具体结果见表6。

表6 河南省动物源粪肠球菌多重耐药结果

3 讨论

近年来，肠球菌已成为医院获得感染的主要病原菌之一，通过天然和获得的多重耐药性，多重耐药性在肠球菌中已普遍存在，并且变得日益严重，对公共卫生安全构成极大威胁[10]。需进一步提高人畜共患菌及动物源细菌的耐药性监测平台[11]。

本研究通过对河南省规模化猪场、鸡场的粪肠球菌进行分离纯化、鉴定及耐药性试验，共分离粪肠球菌254株，分离率52.90%(254/480)，其中鸡源高于猪源，分离率分别为55.60%(100/180)和51.30%(154/300)。这一结果比幸文定[12]研究的江西省7个地区总分离率64.80%要高，比苏崴艺等[13]从辽宁省鸡场分离率为24.0%和Woods S E等[14]从猕猴中的分离率为33.33%(15/45)要高。表明不同动物来源、不同地区粪肠球菌分离率存在差异。

分离的254株粪肠球菌对头孢西丁、克林霉素、泰妙菌素、磺胺异恶唑、红霉素、替米考星、头孢噻呋的耐药率均超过90%。其中猪源粪肠球菌对氟苯尼考耐药率比鸡源高出60%以上，对复方新诺明、利萘唑胺的耐药率比鸡源高出20%以上；鸡源粪肠球菌对青霉素、氧氟沙星、恩诺沙星的耐药率比猪源高出20%以上，这种差异明显与动物种类及不同动物用药偏好有关，这一结果与商军等[15]研究一致。多重耐药严重，分离的粪肠球菌对7类及7类以上抗菌药物耐药率超过91%，比商军等的研究偏高，表明河南省粪肠球菌的多重耐药已相当严重。

从本次试验结果看，河南省猪、鸡源性粪肠球菌耐药现象已相对较为严重、且多重耐药严峻，猪、鸡源粪肠球菌耐药率存在差异，在今后的管理过程中，应根据不同养殖类型指导养殖企业选择合理药物，改善养殖环境，不断加强动物源细菌耐药性的监测，进一步控制动物源细菌耐药性的产生。

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