犬急性肾毒性肾损伤标志物的筛选

王晓朋，侯艳丽，邹颂平，张梦丹，罗俊崇，王 凯*

(1.佛山科学技术学院，广东佛山 528000；2.四会市畜牧兽医局，广东肇庆 526000)

犬急性肾损伤(acute kidney injury ,AKI)多为可逆性损伤，及时发现和治疗可防止其发展成为实质性肾衰[1]。临床试验数据表明，AKI缺乏早期诊断指标和有效干预，是造成动物死亡的重要原因，干预的滞后性是因为缺乏有价值的早期的肾损伤标志物。目前，检测肾脏损伤主要指标为血清肌酐(creatinine,CREA)和尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)。大量临床资料表明，CREA和BUN并不是肾损伤的敏感指标，肾脏的排泄功能丧失50%以上时，血清中CREA和BUN才可能会明显升高，且出生1周内的小狗即使有肾脏损伤，其CREA和BUN也不会升高[2]。犬肾损伤早期诊断标志物的缺乏造成许多患病动物错失最佳干预时机，因此探究早期、灵敏、特异的犬肾损伤标志物对于临床上早期诊断肾脏疾病，及时进行干预和治疗具有重要的意义。随着疾病发生原因的复杂化和联合用药的广泛化，肾毒性药物成为导致AKI的重要原因之一，医学上20%的AKI是由药物导致的[3]，因此研究肾毒性肾损伤标志物，对于此类疾病的早期诊断和治疗具有重要意义。

急性肾损伤标志物是肾脏受到损害时能够快速、灵敏地检测出肾脏早期的、低水平的一种生物标志物，是当前医学上肾脏损伤研究的热点之一。目前，有文献报道的与肾脏有关的肾损伤标志物已达30多种，且视黄醇结合蛋白(N-acetyl-β- glucosaminidase，RBP)和N-乙酰-β氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β- glucosaminidase，NAG) 已成为人类医学上经典的肾小管损伤标志物，能够反映肾小管的功能变化[4]。新的肾损伤标志物也逐渐被发现，一些特异性、灵敏度高的的肾小管损伤标志物已在试验研究和临床观察中得到了部分验证，如肾损伤分子(kidney injury molecule，KIM-1)和中性粒细胞明胶酶运载脂蛋白(neutrophil gelatinase relted lipid transfer protein，NGAL)。目前，肾损伤标志物的研究仅在急性肾脏损伤的病人和大鼠上进行，而兽医临床上对于这方面的研究基本处于空白阶段。随着小动物诊疗技术的飞速发展，快速、灵敏、 高效、敏感的肾损伤标志物成为临床诊断肾脏损伤的新需求。本试验通过复制肾毒性肾损伤模型，通过对比分析的方法筛选犬急性肾损伤标志物，为犬肾脏损伤早期敏感标志物的筛选提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物 8月龄10 kg±1 kg的中华田园犬10只，雌雄各半，单笼常规饲养，饲喂全价商品犬粮，常规免疫、驱虫后开始试验。

1.1.2 试剂 异氟烷，河北一品制药有限公司产品；硫酸庆大霉素注射液，遂成药业股份有限公司产品；RBP、NGAL、KIM-1、NAG ELISA检测试剂盒，上海酶联生物科技有限公司产品。

1.1.3 仪器设备 切片机(RM 2016)、组织包埋机(KD-BM)，浙江省金华市科迪仪器设备有限公司产品；酶标仪(iMark Bio-Rad Laboratories,Inc.)、全自动生化分析仪，SP-4430 爱科来医疗电子有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 试验分组与犬肾毒性肾损伤模型的复制 试验犬随机编号为1号～10号犬。注射药物前检测每只试验犬尿液和血液中RBP、NAG、KIM-1、NGAL浓度作为自身对照。按照每千克体重8万单位的剂量于每天上午9点一次性皮下注射硫酸庆大霉素，连续注射9 d[5]。注射药物后每天检测尿液、血液生物标志物浓度数据各作为1个试验组数据。注射药物6 h后采集试验犬尿液和静脉血液，样品采集期间试验犬应禁食，给予少量饮水。样品收集后3 000 r/min离心5 min，取上清液放置在-80℃保存，用于检测尿液和血液中RBP、NAG、KIM-1、NGAL的浓度。试验第3天、第6天、第9天随机选取1只试验犬，安乐后取肾脏，用于组织病理组织学检查。

1.2.2 血清CREA、BUN浓度的检测 于试验前、试验第3天、第6天、第9天，采集试验动物前肢静脉血，5 000 r/min离心5min，取上清液进行血清生化检测。

1.2.3 尿液和血清中肾损伤生物标志物浓度的检测 按照产品说明书，依次检测尿液和血液中RBP、NAG、KIM-1、NGAL的浓度。对于超出检测正常范围的检测样品，稀释一定的比例后再进行检测。

2 结果

2.1 试验犬临床观察

试验犬试验第5天开始食欲下降，呕吐，多尿，饮水量增多，精神萎靡，试验第7天尿量减少，试验第9天机体脱水明显，体重降低显著，基本无尿。

2.2 肾脏组织病理学检查及肾损伤评

由图1肾脏病理学检查结果显示，试验犬在给药后出现了与庆大霉素肾毒性肾损伤相关的典型的肾脏病理学变化。改变主要包括肾小管内血液淤积，上皮细胞变性，坏死，肾小管腔扩张，小管管型，肾小管基底膜裸露。随用药时间的延长，肾脏损伤程度逐渐加重，试验第3天肾小管出现血液淤积，小管细胞脱落，肾脏轻度损伤。试验第6天，肾小管管腔扩张，部分肾小管坏死，管腔内有小管管型，肾脏中度至重度损伤。试验第9天，肾小管坏死严重，基底膜脱落，肾小管肿胀，肾脏重度损伤。

a.表示正常肾小管； b.表示血细胞淤积； c.表示肾小管细胞脱落；d.表示肾小管脱落坏死；e.表示肾小管基底膜裸露

A.对照肾脏组织；B.用药3天后肾脏组织；C.用药6天后肾脏组织；D.用药9天后肾脏组织

a.Indicates normal renal tubules；b.Indicates blood cell deposition；c.Indicates renal tubular cell abscission；d.Indicates renal tubular necrosis；e.Indicates bare basement membrane of renal tubule

A.The kidney tissue of the control group; B.The kidney tissue after adminstration for 3 days; C.The kidney tissue after adminstration for 6 days; D.The kidney tissue after adminstration for 9 days

图1给药前后犬肾脏病理变化(HE 40×)

Fig.1 Histopathological lesions of canine kidney before and after administration(HE 40×)

2.3 肾脏B超检查结果

从B超图2可知，用药6 d前，肾脏轮廓清晰，大小几乎没有改变，第9天肾脏轮廓略模糊，肾皮质和肾髓质界限不清晰，皮质回声增强。

A .用药前肾脏B超；B.用药3天肾脏B超；C.用药6天肾脏B超；D.用药9天肾脏B超

A.The B ultrasonic imaging of the kidney in control group; B.The B ultrasonic imaging of the kidney after adminstration for 3 days; C.The B ultrasonic imaging of the kidney after adminstration for 6 days; D.The B ultrasonic imaging of the kidney after adminstration for 9 days

图2给药前后犬肾脏B超图

Fig.2 The B ultrasonic imagings in kidney of dog before and after administration

2.4 试验犬血清生化CREA、BUN浓度检测结果

从表 1中可以看出，试验第3天，血清中CREA、BUN浓度均在正常范围内，肾脏病理检查结果显示肾脏轻度损伤。试验第6天有3只试验犬血清CREA浓度升高，组织病理学结果显示肾脏中度至重度损伤。试验第9天7只试验犬中6只CREA、BUN浓度升高，组织病理学结果显示肾脏损伤非常严重。试验结果表明,血清CREA和BUN对肾脏损伤情况的评估具有滞后性，不灵敏性。

表1 给药前后血清CRE、BUN浓度变化

注：BUN参考范围：2.5 mmoL/L～9.5 mmoL/L，CRE参考范围：44 mmoL/L～159 mmoL/L。

Note:BUN reference range: 2.5 mmol/L-9.5 mmol/L, CRE reference range: 44 mmol/L-159 mmol/L.

2.5 尿液中生物标志物浓度的检测结果

表2结果显示，尿液中RBP、NAG、KIM-1、NGAL浓度随用药时间延长逐渐升高，与肾脏损伤程度有良好的相关性。在试验第1天、第2天、第3天、第4天尿液中KIM-1、NGAL、RBP、NAG浓度分别显著升高(P<0.05)，显著升高时间均早于血清中的CREA和BUN。

表2 给药前后尿液中肾损伤标志物浓度变化

注：同列相同字母标志差异不显著，不同字母表示差异显著。

Note: In the same column, different letters show significant difference, and the same letters show no significant difference.

2.6 血清中生物标志物浓度的检测结果

由表 3 结果可知，血液中RBP、NAG、KIM-1、NGAL浓度随用药时间延长逐渐升高，与肾脏损伤程度有良好的相关性。试验第3天血液中NAG、KIM-1浓度显著高于试验前，显著升高时间早于CREA和BUN。试验第5天血液中RBP、NGAL浓度显著高于试验前，显著升高时间与CREA和BUN 升高时间基本相同。

表3 给药前后肾损伤血清中标志物的浓度变化

注：同列相同字母标志差异不显著，不同字母表示差异显著。

Note: In the same column, different letters show significant difference, and the same letters show no significant difference.

3 讨论

临床观察发现，连续用药5 d，试验犬表现出临床症状，试验第7天临床症状明显，肾脏组织病理学结果显示此时肾脏受损程度为中度至重度。B超检查结果显示，试验过程中肾脏轮廓和大小基本未见明显变化，在连续用药6 d后才可能出现比较明显的肾脏损伤影像，此时肾脏受损程度为中度至重度。血清中检查结果CREA、BUN在连续用药第6天才开始显著升高，肾脏受损程度为中度至重度。以上结果表明，目前采用的肾脏损伤检测方法只有在肾脏受损程度在中度至重度以后才有可能比较明显，不能对肾脏损伤早期做出判断，延误了肾脏损伤的最佳治疗时机。本试验结果表明，尿液和血液中4种肾损伤标志物浓度变化与肾脏损伤具有良好的相关性。尿液中RBP浓度在试验第3天显著升高，早于CREA和BUN升高时间，此时肾脏为轻度损伤，可作为肾毒性肾损伤早期敏感标志物，与杨浩强[6]采用顺铂建立的急性肾损伤模型尿液检测结果相同。血液中RBP浓度在试验第5天显著升高，早于CREA和BUN，但此时肾脏为中度至重度损伤，因此血液中RBP不能作为肾毒性肾损伤早期敏高标志物。尿液和血液中NAG浓度在试验第3天尿液显著升高，早于CREA和BUN升高时间，此时肾脏为轻度损伤，因此可作为肾毒性肾损伤早期敏感标志物。此结果与周晓冰[7]等在硫酸庆大霉素肾毒性损伤模型中检测的结果基本相同，不同的是他们的试验中尿液中NAG在注射药物第1天即显著升高，而本试验是在注射药物第3天浓度显著升高。造成这种差异的原因可能是他们的试验中肾毒性肾损伤模型采用的是肌肉注射硫酸庆大霉素，较皮下注射药物吸收更快、更充分，对肾脏损伤更早更严重，所以NAG尿液浓度才会升高更快。尿液和血液中KIM-1的浓度分别在试验第1天和试验第3天显著升高，早于CREA和BUN升高时间，此时肾脏为轻度损伤，因此可作为肾毒性肾损伤早期敏感标志物，与曾凡智等[8]试验结果相同。尿液中NGAL的浓度在试验第2天显著升高，早于CREA和BUN升高时间，此时肾脏为轻度损伤，因此可作为肾毒性肾损伤早期敏感标志物。此结果与杨浩强在大鼠上的检测结果相同。血液中NGAL的浓度在试验第5天显著升高，早于CREA和BUN的升高时间，但此时肾脏为中度至重度损伤，因此血液中NGAL浓度不能作为肾脏损伤早期敏感标志物。

目前，急性肾损伤标志物的研究主要集中在人类医学尿液标志物的研究，兽医临床在这方面的研究基本处于空白。本试验复制了急性肾毒性肾损伤模型，探索了肾损伤程度与4种肾损伤标志物尿液和血液浓度变化的关系。试验结果表明，尿液中4种肾损标志物浓度变化均与肾损伤程度呈正相关，且升高时间早于CREA、BUN，可作为急性肾损伤早期诊断标志物。血液中4种肾损伤标志物NAG和KIM-1灵敏度较好，可作为肾毒性肾损伤血液中灵敏的肾损伤标志物。临床上血液样品较尿液样品容易采集，筛选出血液和尿液灵敏度都较高的肾损伤标志物，对于兽医临床上急性肾衰竭早期的诊断具有重要意义。综合来说，NAG和KIM-1作为急性肾毒性肾损伤的早期诊断标志物更有利于在兽医临床中开展。

参考文献：

[1] Morgan R V.小动物临床手册[M].4版.施振声，译.北京：中国农业出版，2005：502-509.

[2] Dennis J C，Stephen P D，Patricia A S .犬猫肾脏及泌尿学[M].2版.谭大伦，译.中国台湾：台湾爱思唯尔有限公司，2013：63-92.

[3] 范倩倩，孔旭东，邓 昂，等.药源性急性肾损伤研究进展[J].中国药物警戒，2015(12)：164-168.

[4] Tanlinson P A.Low molecular weight proteins in children with renal disease[J].Pediatr Nephrol，1992(6)：565-571.

[5] 周光兴，高 诚，徐 平， 等.人类疾病动物模型复制方法学[M].上海:上海科学技术文献出版社，2007：502-503.

[6] 杨浩强.尿RBP、NGAL在顺铂致大鼠急性肾损伤中的变化及意义研究[D].广西南宁：广西医科大学，2014.

[7] 周晓冰.大鼠与Beagle犬肾毒性生物标记物及肠道病毒71型灭活疫苗临床前安全性的研究[D].北京：北京协和医学院，2014.

[8] 曾凡智，肖创清，黄志红，等.硫酸庆大霉素诱导大鼠急性肾损伤模型血和尿NGAL、KIM-1的变化及意义[J].实用预防医学， 2016(2)：140-143，165.