发酵对黄芪中黄芪甲苷含量的影响

侯美如，尹珺伊，王 岩，刘 宇，陈楠楠，秦平伟，史同瑞

(黑龙江省兽医科学研究所，黑龙江齐齐哈尔 161006)

黄芪(Astragalus)系常用扶正中药之一，具有益气固表、补气养血、利水消肿、脱毒、敛疮生肌等功能[1]，被广泛应用于人类及动物疾病的预防与治疗中。随着对黄芪制剂研究的逐步深入，应用微生物发酵手段替代传统炮制技术的研究也取得了一定的进展[2]。由于黄芪发酵产物受发酵物料组分、发酵菌种及发酵工艺等因素的影响，因此其有效活性成分的含量也不相同。黄芪中的主要活性成分是黄芪甲苷(astragaloside)，黄芪甲苷也是《中国药典》中黄芪质量标准检测的标志物[3]。由于药典中使用的检测方法是薄层扫描法[4]与高效液相色谱-蒸发光散射检测器(high performance liquid chromatography couple with evaporative light scatting detector，HPLC-WLSD)[3]检测法，这些方法在含量测定中存在着试剂腐蚀性强、试验误差大、蒸发光散射器普及面不广等问题。为丰富黄芪发酵程度及产品质量评价方法，本文应用高效液相色谱-紫外检测法(high performance liquid chromatography couple with ultraviolet detector，HPLC-UV)检测黄芪甲苷含量，同时，比较黄芪固态发酵对黄芪甲苷含量的影响，为发酵黄芪制品的质量控制提供数据支持，为生产应用提供质量保障。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器设备 日本岛津SPD-20A紫外检测器、LC-20AT二元泵、Labsolution色谱工作站，日本岛津公司产品；KQ5200B超声清洗仪，昆山市超声仪器有限公司产品；电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司产品；ZNCL-S自能恒温磁力搅拌器，上海羌强仪器设备有限公司产品；PINE-TREE帕恩特标准试剂级超纯水机，北京湘顺源科技有限公司产品；恒温振荡器HZQ-FX型，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司产品。

1.1.2 菌株与试剂 产纤维素酶解淀粉芽胞杆菌SSY1株，由黑龙江省兽医科学研究所细菌研究室分离鉴定并保存；黄芪甲苷标准品(含量98%，批号20160924)，购自上海金穗生物科技有限公司；黄芪，购自河北凯达药业有限公司；乙腈(色谱纯，批号20161210)、甲醇(色谱纯，批号20161108)，购自天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 标准品制备 精密称取4.8 mg黄芪甲苷标准品，置于10 mL容量瓶中，加入适量流动相，超声溶解，定容至刻度，备用。

1.2.2 发酵黄芪及对照品制备

1.2.2.1 黄芪发酵 按照黄芪粉30%、黄豆粉10%、CaCO30.2%、水59.8%组分制备发酵培养基。取解淀粉芽孢杆菌种子液，以2%接种量接种黄芪发酵培养基，在37℃发酵培养72 h，发酵物中活菌数约为7.67×108CFU/g。

1.2.2.2 对照品 另外取无菌肉汤，按2%接种量接种黄芪固态发酵培养基，按照发酵黄芪制备方法进行发酵培养。

1.2.3 有效成分的提取 取发酵组及对照组固体培养基各5 g，分别加水50 mL，置于微量振荡器上混匀1 h，离心取上清，分别置于分液漏斗中，加入正丁醇50 mL，进行萃取。弃液再次用正丁醇萃取，合并正丁醇萃取液，加入10 g/LNaOH溶液100 mL，洗涤3次，除色素后用超纯水洗至中性，收集正丁醇溶液，置70℃水浴挥干溶剂，加甲醇溶解，待完全溶解后定容至5 mL，摇匀，经0.45 μm滤膜过滤，超声除气，备用。

1.2.4 色谱条件 Inertsustain C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈、水(32∶68)，检测波长203 nm，柱温25 ℃，流速1 mL/min，进样量：20 μL。

1.2.5 系统适应性试验 分别取标准品、发酵黄芪组及对照组黄芪甲苷提取液，经超声，过0.45 μm滤膜后进样20 μL，对方法系统适应性进行考察。

1.2.6 线性关系考察 用流动相稀释黄芪甲苷标准品溶液，稀释浓度分别为0.48、0.36、0.24、0.12、0.06 mg/mL，摇匀，经0.45 μm滤膜过滤，超声除气，备用。按上述色谱条件对黄芪甲苷含量进行测定，以液相色谱峰峰面积(A)对浓度(C)绘制标准曲线。

1.2.7 精密度试验 精密吸取黄芪甲苷标准品溶液20 μL，重复进针6次，测定的黄芪甲苷峰面积，对方法精密度进行考察。

1.2.8 稳定性试验 取黄芪甲苷标准品分别于0、2、4、6、8、10 h进样1次，对方法稳定性进行考察。

1.2.9 加样回收率试验 精密称取已知含量的黄芪粉末各3份，分别加入黄芪甲苷标准品溶液0.5、0.25、0.125 mL，按1.2.3有效成分的提取方法进行操作，测定峰面积，计算回收率。

1.2.10 样品含量测定 取黄芪发酵组及对照组黄芪甲苷提取液各20 μL，按上述色谱条件对黄芪甲苷含量进行测定。

2 结果

2.1 系统适应性试验

由图1可知，标准品、发酵黄芪组及对照组黄芪甲苷提取液分别在2.149、2.165、2.157 min的保留时间出现独立峰。

2.2 线性关系考察

以液相色谱峰峰面积(A)对浓度(C)绘制标准曲线，结果见图2。其回归曲线为A=2 034 519.61C-4711.54，相关系数R2=0.999 3，线性范围为0.06 mg/mL～0.48 mg/mL，结果表明线性回归较好。

A.黄芪甲苷标准品色谱图；B.对照组及发酵组黄芪甲苷色谱图；1.黄芪甲苷标准品；2.发酵组黄芪甲苷；3.对照组黄芪甲苷

A.Chromatogram of astragaloside standard; B.Chromatograms of astragaloside in control group and fermentation group；1.Astragaloside standard; 2.Fermentation group astragaloside; 3.Control group astragaloside

图1黄芪甲苷色谱图

Fig.1 Chromatogram of astragaloside

图2 黄芪甲苷标准曲线

2.3 精密度试验

黄芪甲苷标准品溶液，重复进针6次，测定的黄芪甲苷峰面积分别为700 587、683 752、712 945、694 757、705 461，RSD为1.58%，表明方法精密度符合要求。

2.4 稳定性试验

对黄芪甲苷标准品于不同时间点进针，测得峰面积分别为700 587、723 413、695 423、687 562、713 549，RSD为2.04%，结果表明，黄芪甲苷在10 h内稳定性良好。

2.5 加样回收率试验

由表1可以看出，该方法回收率高，稳定性强，平均回收率可达99.75%。

表1 回收率试验结果

2.6 样品含量测定

由表2可知，经37℃恒温培养72 h，黄芪发酵组与不接菌对照组黄芪甲苷质量分别为6.336 mg/g±0.002 1 mg/g和4.593 mg/g±0.002 5 mg/g，发酵组黄芪甲苷含量明显高于对照组，较对照组高37.95%。

表2 发酵黄芪中总皂苷含量的变化

3 讨论

黄芪甲苷含量的检测方法有薄层色谱法、香草醛-比色法及高效液相色谱法等。已有报道中多采用薄层色谱法，且在2000版《中国药典》[4]及2000年版《中国兽药典》[5]均应用薄层色谱法检测黄芪甲苷含量，该方法能够提供图像用以直接观测并传达色谱结果，制备量大，成本低，速度快，但前处理步骤较多，人为影响因素大，排除干扰困难，准确度差，重现性不好[6]。香草醛-比色法所用试剂具有刺激性气味，腐蚀性强，操作人员需做好必要的防护。由于黄芪甲苷仅在波长200 nm处附近有末端吸收，因此，在《中华人民共和国药典》2010年版一部及2015年版一部[3,7]中均采用蒸发光散射器(HPLC-ELSD)对黄芪甲苷含量进行检测，但蒸发光散射器成本高，普及率低，还需要配置高压氮气或空气，且试验中还产生有害废气。紫外检测器为高相液相色谱的标准配置，不仅灵敏度高、噪音低、线性范围宽、有较好的选择性，且对环境温度、流动相组成变化和流速波动不太敏感，可等浓度洗脱，亦可梯度洗脱。因此，HLPC-UV法更易被广泛的应用于黄芪甲苷的质量检测。

对于HLPC-UV方法中检测波长和流动相的选择上，由于黄芪甲苷在近紫外区仅在200 nm左右有末端吸收，文献中多在200 nm～210 nm处选择检测波长，波长越长噪音越小，但灵敏度亦下降，常选用的波长为200、203、205 nm处，检测流动相多以乙腈-水，选取的浓度不尽相同[8-12]。通过对以往报道中的检测波长及浓度进行筛选，本文建立的HPLC-UV色谱检测条件采用了等浓度洗脱，流动相选择乙腈∶水(32∶68)、流速1.0 mL/min、检测波长为203 nm，试验证明，该条件下黄芪甲苷的峰形对称，尖锐，与样品本底有良好的分离，且该方法在0.06 mg/mL～0.48 mg/mL范围内线性关系良好，精密度及回收率高，稳定性好，适用于固态发酵黄芪中黄芪甲苷含量的检测。

本文应用分离的解淀粉芽胞杆菌对黄芪固体发酵72 h，经液相色谱法测定，黄芪甲苷质量分数较对照组提高了37.95%，这与许多学者的研究结果相一致。王士中[13]运用糙皮侧耳菌对黄芪进行发酵，经检测发现发酵后黄芪甲苷含量增加，但增加幅度不高，其推测是由于糙皮侧耳菌在发酵生产过程中产生的丰富酶系，如纤维素酶、半纤维素酶、漆酶及果胶酶等，对黄芪中木质纤维素、半纤维素、木质素及果胶等物质进行分解利用，将黄芪的活性成分充分释放，使黄芪甲苷含量增加。孙豪栋[14]通过筛选和诱变育种，获得可以将黄芪皂苷转化为黄芪甲苷的微生物菌株，以突变的伞枝犁头霉作为菌种，进行发酵处理，使黄芪甲苷产率从28.3%增加至31.1%，进一步优化培养条件，黄芪甲苷产率最高可达42.86%。马伟等[15]运用保加利亚乳酸杆菌发酵黄芪，其黄芪总皂苷质量分数显著升高，增长了22%。而郁帅陆等[16]运用灵芝液体种子液对黄芪固体培养基进行发酵，发现黄芪甲苷含量降低，其推测可能因高温灭菌，使连接苷元和多糖的多糖苷键部分断裂，并生成非极性皂苷元，而不能经极性较大的甲醇提取到，使检测结果降低。

由于发酵技术的影响因素是多方面的，受到发酵菌种、发酵成分及发酵条件等因素的影响，产生的活性物质也有所增加或减少，原因也各异，本试验仅对黄芪甲苷的含量变化进行了测定，而并未对其他成分变化进行检测。为探究引起成分增加的原因，笔者对本文分离得的解淀粉芽胞杆菌产纤维素酶性质进行了研究，发现该菌种具有产纤维素酶的能力。有报道指出纤维素酶可提高黄芪有效成分的释放[17]，这可能是本试验发酵黄芪甲苷含量增加的原因之一。但本试验导致黄芪甲苷含量增加的原因，是解淀粉芽胞杆菌产纤维素酶分解细胞壁，使有效成分释放，或是由菌种将黄芪皂苷转化为黄芪甲苷，亦或是由非极性皂苷元转化为可溶于甲醇溶剂皂苷的结果，仍需进一步的试验和数据加以证实。

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