重组禽腺联病毒介导的人溶菌酶在蛋清中的表达

吴 植，朱善元，顾玲玲，张继玲，吴 萌，崔潇婷，王安平

(江苏农牧科技职业学院，江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室，江苏泰州 225300)

溶菌酶(lysozyme，LYZ)又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，广泛存在于牛奶、唾液、哺乳动物泪水及禽类蛋白中[1]。人溶菌酶(human lysozyme，hLYZ)由130个氨基酸残基组成，分子质量为14.7 ku[2]，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的功效，并且对人体完全无毒害、无副作用，在临床和食品工业等领域被广泛应用[3]。

天然hLYZ 可以从人乳、胎盘或唾液中少量提取，但来源极为有限。已有用大肠埃希菌、酵母和植物表达重组hLYZ的报道，但细菌表达的hLYZ是无活性的包涵体，真核细胞的表达水平低、成本高[4-6]。

腺联病毒属细小病毒科依赖病毒属，是一种复制缺陷型单链DNA病毒，需要腺病毒等辅助病毒才能复制产生子代病毒。重组腺联病毒(Recombinant avian adeno-associated virus,rAAAV)是目前公认的最有前景的基因转移载体之一，具备对宿主没有致病性、免疫原性极低、宿主范围广等优点，广泛地用于基因治疗和基因工程疫苗等方面的研究[7]。本研究利用重组禽腺联病毒研究人溶菌酶在鸡蛋清中的表达情况，为人溶菌酶的应用研究提供新方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、菌种与试验用动物 含hLYZ输卵管特异表达框的重组禽腺联病毒(rAAAV-OVLYZ)由江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室提供；微球菌由扬州大学医学院微生物教研组提供；邵伯蛋鸡由中国农业科学院家禽研究所提供。

1.1.2 工具酶与试剂 人溶菌酶检测试剂盒、人溶菌酶标准品、人溶菌酶单抗，Abcam公司产品；DNA Polymerase、DNase Ⅰ、Trizol RNA抽提试剂盒，Fermentas公司产品；HRP标记的羊抗鼠IgG，KPL公司产品；其他试剂均为国产分析纯级。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 根据已发表的hLYZ基因序列(NM-000239)设计1对引物，以扩增长度约为400 bp的开放阅读框，其序列分别为：5′-GTACTCGAGATGAAGGTCTTTGAAAGGTGTG-3′and 5′-GTACTCGAGTTACACTCCACAACCTTGAACA-3′， 引物由上海英潍捷基生物技术有限公司合成。

1.2.2 rAAAV-OVLYZ的产蛋鸡动物试验 将制备纯化好的rAAAV-OVLYZ以每只鸡2×1011病毒颗粒(vector genomes，v.g.)经翅静脉注射5只正常产蛋母鸡，以注射生理盐水的正常产蛋母鸡为对照。从注射的次日起收集鸡蛋，无菌收集浓蛋清，置-20℃保存备用。

1.2.3 蛋清中hLYZ含量的测定 为检测重组病毒注射后蛋清中hLYZ的表达水平，每只鸡每星期收集4个～5个鸡蛋，取其浓蛋清合并，参照人溶菌酶检测试剂盒说明书，检测蛋清中hLYZ的含量，分别以正常蛋清和注射生理盐水的产蛋鸡蛋清作为正常对照和阴性对照。

1.2.4 目的基因表达的RT-PCR检测 在重组病毒注射后的第12周，产蛋鸡试验结束后进行宰杀，取其输卵管膨大部、心、肝、脾、肺、肾、肌肉等组织，参照Trizol RNA抽提说明书提取总RNA，用DNase Ⅰ 37℃消化15 min，去除其中可能残余的DNA。然后参照RT-PCR试剂盒说明书，以hLYZ特异性引物进行检测，RT反应体系为20 μL，包括RNA 1 μg，反向引物10 pmol ，10×缓冲液2 μL，dNTPs 10 pmol ，RNA抑制剂0.5 pmol ，反转录酶1 μL；反应程序为37℃ 60 min；50 μL PCR反应体系包括2 μL RT产物、15 pmol正、反向引物，5 μL 10×缓冲液，2.5 U DNA Polymerase；35次循环的PCR程序为95 ℃/30 s(第1次循环为4 min)、58 ℃ 30 s和72 ℃ 30 s(最后1次循环为8 min)。反应结束后，取8 μL扩增产物进行12 g/L琼脂糖凝胶电泳分析。

1.2.5 目的蛋白的Western blot检测 取15 μL蛋清样品，加入5×loading buffer煮沸3 min后，取15 μL进行SDS-PAGE分析，以人溶菌酶标准品作为阳性对照，以注射重组病毒前的蛋清作为阴性对照。样品电泳结束后转印至PVDF膜，以抗hLYZ单抗为一抗，以HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，按常规方法进行Western blot反应，最后用DAB显色试剂盒显色观察。

1.2.6 重组蛋白的体外抑菌试验 采用管碟法对蛋清中重组蛋白的抑菌活性进行检测。取15 μL处于对数生长期的微球菌菌液稀释于150 μL灭菌水中，均匀涂布于LB琼脂板表面，将直径约6 mm的无菌不锈钢小管放在平板表面，于管内滴加100 μL 50倍稀释的待检蛋清，放置于37 ℃恒温箱中培养，18 h后观察结果。

2 结果

2.1 蛋清中hLYZ的表达动态

为检测注射病毒后蛋清中重组hLYZ的表达水平，每只鸡每周收集4个～5个鸡蛋，取浓蛋清用人溶菌酶检测试剂盒检测其表达水平。结果显示在注射重组病毒的第1周hLYZ的平均表达量可达25.8 μg/mL，在第5周达到最高68.3 μg/mL，然后慢慢降至32.6 μg/mL，表达时间持续3个月之久(图1)。

2.2 目的基因表达的RT-PCR检测

为了检测rAAAV-OVLYZ介导的外源基因的表达是否具有良好的组织特异性，提取注射重组病毒鸡和不注射重组病毒鸡不同组织总RNA，以针对hLYZ开放阅读框的特异性引物进行RT-PCR检测。结果显示只在注射重组病毒后鸡的输卵管膨大部组织中扩增出预期大小的特异性条带，在其他组织中及未注射重组病毒鸡的各组织中均未扩增出目的条带(图2)。

图1 rAAAV-OVLYZ注射鸡蛋清中hLYZ的表达动态

M.DNA 标准DL 2 000; 1～7.重组病毒注射鸡的输卵管(膨大部)、心、肝、脾、肺、肾、肌肉; 8.阴性对照

M.DNA marker DL 2 000; 1-7.oviduct，heart，liver，spleen，lung，kidney，muscle of rAAAV-injected hens; 8.Negative control

图2重组病毒注射后鸡组织中hLYZ基因的RT-PCR检测

Fig.2 Transcription of hLYZ gene in tissues of rAAAV-OVLYZ injected laying hens

2.3 重组蛋白的Western blot检测

为检测重组蛋白的大小，以人溶菌酶单抗为一抗，HRP-标记的羊抗鼠IgG为二抗，对样品进行Western blot检测，结果显示在14.7 ku处有特异性条带，而在未注射重组病毒的蛋清中未捡到目的条带(图3)。

2.4 重组蛋白的体外抑菌活性

选取工程菌微球菌为检测菌，在细菌平板上分别加入稀释后的重组蛋清，hLYZ活性检测结果显示，注射重组病毒蛋清的抑菌圈明显大于正常蛋清的抑菌圈(图4)。

M.蛋白分子质量标准；1.hLYZ标准品；2.含重组LYZ的蛋清；3.空白对照

M.Protein molecular weight Marker；1.The hLYZ standard; 2.The egg whites with recombinant LYZ; 3.Negative control

图3重组蛋白LYZ的Western blot检测

Fig.3 Western blot analysis of recombinant protein LYZ

A、B.待检蛋清; C.正常蛋清; D.无菌PBS

A,B.the pooled egg whites of 5 hens; C.The normal egg white; D.The sterile PBS

图4人溶菌酶的抑菌活性测定

Fig.4 Determination of antibacterial activity of hLYZ

3 讨论

鸡输卵管生物反应器是一种极具吸引力的生产重组蛋白的新平台，在生物制药业中具有广阔的应用前景，已有成功培育出表达干扰素、促红细胞生成素、人生长因子等的转基因鸡的报道，但转基因鸡的培育存在操作复杂、周期长、成本高等缺点[8-10]。因此，将外源蛋白在鸡输卵管上皮细胞中进行暂态表达不失为一个好的选择。高波等[11]利用含有输卵管特异性启动子的重组质粒建立了鸡输卵管暂态表达体系，虽然这种方法操作简单、成本较低，但存在表达水平较低、表达时间短的弊端。

重组禽腺联病毒已被证实是一种良好的基因转移载体，能介导外源基因在体外进行高水平、长时效的表达。Perozo F等[12-13]以重组AAAV为载体分别构建了表达NDV和IBDV保护性抗原的基因工程疫苗，取得了良好的保护效果，Wang Y J等[14]将RNA技术与rAAAV载体相结合，结果显示rAAAV能介导miRNA的表达，并能在细胞水平和鸡胚水平充分抑制鸡法氏囊病毒的复制。笔者在前期研究中，用三质粒法制备的rAAAV可介导人组织激肽释放酶在蛋清中高效特异表达6周[15]。

本研究用含hLYZ输卵管特异表达框的重组禽腺联病毒翅静脉注射产蛋母鸡，RT-PCR检测结果显示重组病毒能介导目的基因在输卵管上皮组织特异表达，而在其他组织中未检测到目的基因表达。Western blot检测结果显示重组蛋白大小与预期一致。抑菌活性检测也表明注射了重组病毒的重组蛋清的抑菌活性明显优于正常蛋清的。表达动态水平检测结果显示，第1周即可检测到目的蛋白的表达，第五周时表达水平达最高68.3 μg/mL，然后慢慢降至32.6 μg/mL，表达时间持续3个月之久。Cao D N等[16]利用慢病毒载体制备转基因鸡表达人溶菌酶，G1代表达水平约为57.66 μg/mL。朱秋菊等[17]报道利用表达人溶菌酶的重组质粒注射产蛋鸡，表达水平约维持10 d。本研究利用重组禽腺联病毒表达的人溶菌酶水平与转基因鸡水平相当，与质粒介导的人溶菌酶表达时间仅为10 d相比，重组病毒一次注射目的蛋白表达时间可维持约3个月之久。后续试验，笔者将尝试采用重复注射的方式以继续提高蛋清中人溶菌酶的浓度并延长其表达时间。

参考文献:

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